ELISA定量检测抗dsDNA抗体试剂盒性能验证方法的探讨

周晖 ，江楚文，方伟，梁敏文，黄锦维 ，侯铁英

(广东省人民医院广东省医学科学院a.检验科，b.广东省临床检验中心，广州 510080)

·质量管理研究·

ELISA定量检测抗dsDNA抗体试剂盒性能验证方法的探讨

周晖a，江楚文b，方伟a，梁敏文a，黄锦维a，侯铁英a

(广东省人民医院广东省医学科学院a.检验科，b.广东省临床检验中心，广州 510080)

目的 探讨ELISA定量检测抗双链DNA抗体(下简称抗dsDNA抗体)试剂盒的性能验证方法。方法 依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)批准的EP15-A2文件方法验证精密度。通过检测过往室间质量评价(external quality assessment，EQA)质评物、与比较试剂进行比较、回收试验等3种方法验证准确度。通过检测空白样本验证检测低限(lower limit of detection, LLD)。通过《CNAS-CL39：医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学检验领域的应用说明》、CLSI C28-A3C文件提供的方法验证临界值。通过改良的Doumas法验证线性范围。结果 实测批内、批间变异系数均小于厂家声称的变异系数或按EP15-A2公式计算的验证值。检测EQA质评物阴性符合率为98.4%(63/64)，阳性符合率为100%(20/20)，总符合率为98.8%(83/84)。与比较试剂的阴性符合率为91.2%(52/57)，阳性符合率为87.0%(40/46)，总符合率为89.3%(92/103)，Kappa值为0.783(P=0.062)，两种试剂具有优秀的一致性。平均回收率为99.65%。3种方法验证准确性均通过。实测LLD为0.5 IU/mL，低于厂家声称的1 IU/mL。按CNAS-CL39方法，实测的临界值为18.51 IU/mL，与说明书建议的20 IU/mL接近。按C28-A3C方法，临界值验证也通过。线性回归方程为Y=0.978 8X-3.125 4，r2为0.996 1，截距项-3.125 4与0差异无统计学意义(t=-0.772，P=0.483)。线性范围是1.6～212.5 IU/mL，与厂家声明一致，线性验证通过。结论 候选抗ds-DNA抗体试剂盒的精密度、准确度、LLD、临界值、线性范围与厂家的声明一致，能满足临床诊断与治疗的需要。本研究采用的一系列验证方法为ELISA定量检测试剂的性能验证提供了新思路。

抗双链DNA抗体；酶联免疫吸附试验；性能验证

中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)发布的《CNAS-CL02：医学实验室质量和能力认可准则》(ISO 15189：2012，IDT)中5.5.1.2条款要求[1]：在常规应用前，实验室应对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。《CNAS-CL39：医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性检验领域的应用说明》[2]中，则根据临床免疫学检验的特性对此作了进一步的说明，要求检验方法和程序的分析性能验证内容至少应包括：检出限、符合率，如为定量方法应验证精密度。我国卫生部颁布的《三级综合医院评审标准实施细则》(2011年版)也要求对检验程序进行方法学验证。尽管如此，免疫学检验特别是ELISA方法并没有统一、公认、可行性强的性能验证指标及方法。我科近期对德国ORGENTEC公司ELISA定量检测抗双链DNA(dsDNA)抗体-IgG试剂盒进行了性能验证，报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 检验科-70 ℃冻存的2010年至2015年国家卫生和计划生育委员会临床检验中心、美国病理学家协会(College of American Pathologists, CAP)、德国欧蒙公司等组织的室间质量评价(external quality assessment，EQA)提供的抗dsDNA抗体质评物共计84份，其中64份预期结果为阴性，20份为阳性。另收集在广东省人民医院进行抗dsDNA抗体检测的患者血清样本103份，已获患者知情同意。

1.2 试剂与仪器 抗dsDNA(IgG)抗体定量检测试剂盒(ELISA，德国ORGENTEC公司、德国欧蒙公司)，Multiskan FC酶标仪、Wellwash Vesa洗板机(芬兰Thermo Labsystems公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 精密度验证 依据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)批准的EP15-A2文件方法[3]，取2份不同浓度血清样本。每天检测1批次，每份标本每批平行检测3孔，共测5 d，计算批内变异系数(CVr)和实验室内变异系数(CVl)，CVl即批间变异系数。若测得的CVr、CVl小于厂家声称的批内变异系数(CVr-厂)和批间变异系数(CVl-厂)，则精密度验证通过；若大于厂家声称值，则按EP15-A2的公式计算验证值，若测得的CVr、CVl小于验证值，则精密度验证通过。

1.3.2 准确度验证

1.3.2.1 检测过往EQA质评物 检测本室冻存的过往EQA质评物共计84份，计算阴性符合率、阳性符合率和总符合率。测定结果可接受性标准为阳性(反应性)或阴性(非反应性)结果符合。参照国家卫生和计划生育委员会临床检验中心室间质量评价标准，计算能力比对分析(proficiency testing, PT)得分(可接受结果个数占总的测定样本数的百分比，即总符合率)，≥80%则验证通过。

1.3.2.2 与欧蒙公司试剂的比较 用欧蒙公司试剂、待验证的ORGENTEC公司试剂同时检测103份血清样本抗dsDNA抗体。测量结果高于临界值(cut-off值)判断为阳性，低于临界值判断为阴性。由于2种试剂临界值不同，欧蒙试剂为100 IU/mL、ORGENTEC试剂为20 IU/mL，因此仅计算定性结果的阴性、阳性符合率，评价一致程度。

1.3.2.3 回收试验 选择高、中、低浓度(含有临界值附近浓度)的5份不同患者样本，360 μL患者样本分别加40 μL试剂盒自带标准品(浓度为200 IU/mL)或样本稀释液，分别制成回收样本或对照样本，每个样本平行测试2次，计算回收率。评判标准参考国家卫生和计划生育委员会临床检验中心室间质量评价标准中IgG的可接受范围±25%，回收率在75%～125%之间为合格。

方法二：参考CLSI C28-A3C文件[5]，测定40例体检健康者标本，结果用“1/3”规则进行离群值检验。发现的离群值均弃去，并用新的参考个体代替，确保40例测试结果不含离群值。若40例标本检测结果均小于cut-off值或仅有4个标本超出，则验证通过。否则，进行cut-off值确立试验。

1.3.5 线性范围验证 按改良的Doumas法[6]，取低浓度(L)和高浓度(H)的患者混合血清各1份，浓度覆盖试剂盒说明书给定的线性范围，按L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、L+4H、H的比例配制成6个浓度系列血清，以预期值为横坐标(X)，实测值为纵坐标(Y)，利用SPSS软件求回归方程Y=b0+b1X和相关系数(r)，若r2>0.95,b1在0.97～1.03之间,b0与0差异无统计学意义，则该测定方法的线性范围在实验已涉及浓度内。

1.4 统计学分析 用SPSS 17.0 软件进行。两种试剂定性结果的比较采用McNemar检验，一致性采用κ系数检验，Kappa值大于0.75一般表示认为具有优秀的一致性，0.40-0.75认为相当好的一致性，低于0.40代表很差的一致性。数据的正态性检验采用Shapiro-Wilk法。回归方程中的截距项b0与0的比较采用t检验。

2 结果

2.1 抗dsDNA抗体精密度验证结果 测得2个水平血清样本的批内变异系数(CVr)均小于CVr-厂。水平1的CVl小于CVl-厂, 水平2的CVl(7.7%)略大于CVl-厂(7.3%)，但小于按EP15-A2文件公式计算的实验室内验证CV值(11.8%)。见表1。精密度验证通过。

表1 抗dsDNA抗体精密度验证结果

2.2 准确度验证结果

2.2.1 检测过往EQA质评物结果 阴性符合率为98.4%(63/64)，阳性符合率为100%(20/20)。总符合率为98.8%(83/84)，大于80%，准确度验证通过。20份阳性样品覆盖了高、中、低浓度，其中6份结果>100 IU/mL，7份在41～100 IU/mL之间，7份在21～40 IU/mL之间。

2.2.2 与欧蒙公司试剂的比较 两种试剂检测103份患者样本，欧蒙试剂阳性率为44.7%(46/103)，ORGENTEC试剂为43.7%(45/103)，两种试剂检测抗dsDNA抗体阳性率差异无统计学意义，McNemar检验P值为1.000。以欧蒙试剂为评价标准，阴性符合率为91.2%(52/57)，阳性符合率为87.0%(40/46)，总符合率为89.3%(92/103)，Kappa值为0.783，P=0.062，两种试剂具有优秀的一致性。46份欧蒙试剂阳性样本覆盖了高、中、低浓度，其中16份小于2倍cut-off值，20份在2～5倍cut-off值之间，10份大于5倍cut-off值。见表2。

表2 ORGENTEC试剂和欧蒙试剂检测抗dsDNA抗体检测结果

ORGENTEC试剂+-合计欧蒙试剂+40646-55257合计4558103

2.2.3 回收试验 平均回收率为99.65%，准确性验证合格。见表3。

表3 抗dsDNA抗体检测回收试验结果

2.5 线性范围验证结果 求得回归方程为Y=0.977 8X-3.125 4，r2为0.996 1，大于0.95。b1为0.978 8，在0.97～1.03之间。b0为-3.125 4，与0差异无统计学意义(t=-0.772，P=0.483)，见图1。线性范围是1.6～212.5 IU/mL，与厂家声明的0～200 IU/mL相符合，线性验证通过。

图1 抗dsDNA抗体检测线性拟合曲线

3 讨论

目前国内外的指南、标准要求分析性能验证的指标主要有精密度、准确度、检测低限、参考范围、线性范围等。ELISA法属于临床免疫检验的范畴，虽然可以定量检测，但仍具有不同于临床化学定量分析的特点，为此本研究结合免疫学、临床化学检验的特点，参考国内外标准，对试剂盒进行性能验证。

ELISA法CVr通常小于10%～15%，CVl通常小于15%～20%，并且在不同浓度水平的精密度可能不同，浓度越高，精密度越好。本研究采用EP15-A2文件提供的方法[3]，选择接近厂家声称水平的样本对精密度进行验证。结果cut-off值(20 IU/mL)附近的低水平、中水平样本的批内、批间CV均接近厂家声称值。声称及验证的CVr均小于5.0%，CVl均小于13.0%，符合行内共识。

准确度的验证方法常有：(1)检测参考物质，(2)检测临床诊断明确的阴阳性样品，(3)检测EQA质评物，(4)与其他分析方法比对，(5)回收试验[3，7]。首先，抗dsDNA抗体国际参考品是WHO Wo/80(200 IU/mL)，常规实验室难以获得；其次，抗dsDNA抗体在SLE中的阳性率为35.1%～78%[8]，且抗体水平随病情、治疗而变化。故不考虑采用第1、2种方法。国家卫生和计划生育委员会临床检验中心、美国CAP是组织临床检验EQA的国内外权威机构，德国欧蒙公司也组织全球自身抗体EQA多年。用ORGENTEC试剂检测上述3家机构提供的84份EQA质评物，总符合率达98.8%，高于评价标准的80%，验证通过。由于参加EQA实验室使用的方法、试剂、仪器均不统一及技术发展的局限性，目前国内外在抗体检测的EQA中均只评价定性结果，因而第3种方法仅验证了定性结果的准确性。使用第4种方法时，选择了目前国内应用较广泛的德国欧蒙公司ELISA法试剂。比对实验发现2种试剂定性结果具有优秀的一致性，验证通过。第4种方法也仅验证了定性结果的准确性，为此本研究进一步设计回收试验来验证定量结果的准确性，严格按照文献介绍方法进行操作。由于目前没有公认的抗dsDNA抗体的可接受范围，评价标准借用了国家卫生和计划生育委员会临床检验中心EQA评价标准中IgG的可接受范围(±25%),结果表明包括cut-off值附近浓度的低、中、高浓度的5份不同患者样本，回收率在89.0%～115.3%之间，验证通过。

定量ELISA方法的参考范围上限即为cut-off值，作为判断特定疾病、状态或被测量存在或不存在的界限的量值[2]。本研究分别采用CLSI C28-A3、CNAS-CL39文件建议的2种方法验证cut-off值[2，5]，均通过。CLSI C28-A3方法较简单易行，主要针对定量临床实验。但是ELISA法具有临床化学定量实验不同的特点，标本本身的因素可能增加或降低检测值，从而造成假阳性或假阴性，如类风湿因子、补体、药物、内分泌的改变等。CNAS-CL39方法正是充分考虑到内源性因素的影响，使用了患者血清，且可计算cut-off值，因而更为全面可靠。

线性的评价与验证主要有4种方法：目测法、CAP设备委员会(IRC)采用的CAP-IRC法、CLSI采用的EP6-A方法和改良Doumas方法[6]。目测法简单直观，但主观性强、不可靠且不具重复性，CAP-IRC法和EP6-A法均采用了多项式回归分析方法，可较为准确地评价数据的线性模式，但统计处理复杂难懂，一些实验室人员难接受。相比之下，改良Doumas方法简单易懂，用Excel软件即可得到回归方程、相关系数。本研究采用改良Doumas方法验证了ORGENTEC试剂的线性范围，结果通过。

综上所述，德国ORGENTEC公司抗dsDNA抗体试剂盒的精密度、准确度、检测低限、临界值、线性范围经方法学验证，与厂家声明一致，能满足临床诊断与治疗的需要。实验室在常规应用新方法、新试剂前，对于自建检测系统、非配套系统、修改过的检验程序等才需进行完整、繁琐、高成本的性能评价；对于原装配套试剂和仪器、且未加修改的检验程序(即封闭系统)时，只要进行易操作、适用、经济的性能验证，对于待验证的某项指标，采用一种方法即可。本研究采用的一系列方法既结合了免疫和生化，又综合了定性和定量检测的特点与要求，简易、实用，为ELISA定量检测试剂的性能验证提供了新思路。

[1]中国合格评审国家认可委员会.ISO 15189：2012, 医学实验室质量和能力认可准则[M]. 北京：中国计量出版社，2013.

[2]中国合格评审国家认可委员会.CNAS-CL39, 医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性检验领域的应用说明[M].北京：中国计量出版社,2012.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute. EP15-A2. User verification of performance for precision and trueness; Approved guideline-second Edition[S]. Wayne,PA:CLSI, 2005.

[4]张秀明，冯仁丰. 正确理解和使用分析灵敏度及检出限[J].中华检验医学杂志, 2014, 30(9): 669-672.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute. EP28-A3C. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline-third edition[S]. Wayne, PA: CLSI, 2010.

[6]冯仁丰．临床检验质量管理技术基础[M]．上海：上海科学技术文献出版社，2007：138-177．

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. EP12-A2. User protocol for evaluation of qualitative test performance; Approved guideline-second editon[S]. Wayne, PA: CLSI, 2008.

[8]Borba EF, Araujo DB, Bonfá E,etal. Clinical and immunological features of 888 brazilian systemic lupus patients from a monocentric cohort: comparison with other populations[J]. Lupus, 2013, 22(7): 744-749.

(本文编辑：刘群)

Verification for performance of anti-dsDNA antibody quantitative ELISA kit

ZHOUHuia,JIANGChu-wenb,FANGWeia,LIANGMin-wena,HUANGJin-weia，HOUTie-yinga

(a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.GuangdongCenterforClinicalLaboratory,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,Guangdong,China)

Objective To explore the verification methods for the performance of quantitative detection kit of anti-dsDNA antibodiy with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Methods The precision was verified according to the EP15-A2 document approved by the American Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). The accuracy was verified by detecting the samples of previous external quality evaluation(EQA), compared with the comparative kits and recovery test. The lower limit of detection(LLD) was calculated by the results of blank samples. The cut-off value was verified according to the C28-A3C document approved by CLSI and "CNAS-CL39: Guidance on the Application of Accreditation Criteria for the Medical Laboratory Quality and Competence in the Field of Clinical Qualitative Immunology" respectively. The improved Doumas method was used to verify the range of linearity. Results The measured intra-assay and inter-assay coefficients of variation were lower than those announced by the manufacturer or the calculated values according to the EP15-A2 document. The coincidence rates for negative and positive EQA samples between detected and expected values were 98.4%(63/64) and 100%(20/20) respectively. The total coincidence rate was 98.8%(83/84). The coincidence rate for negative and positive samples between the results from candidate and comparative kits were 91.2%(52/57) and 87.0%(40/46) respectively. The total coincidence rate was 89.3%(92/103) and theKappavalue was 0.783(P=0.062), which implied excellent consistency between the two kits. The mean recovery rate was 99.65%. The measured LLD was 0.5 IU/mL which was lower than 1 IU/mL as claimed by the manufacturer. The measured cut-off value according to the CNAS-CL39 document was 18.51 IU/mL, which was close to 20 IU/mL announced by the manufacturer. Based on the C28-A3C method, the cut-off value could be approved. The linear regression equation wasY=0.978 8X-3.125 4,r2=0.996 1. There was no statistical difference between the intercept(-3.125 4) and 0(t=-0.772，P=0.483). The range of linearity was from 1.6 to 212.5 IU/mL, which was consistent with the values declared by the manufacturer. All the verifications of the five performances above-mentioned could be passed. Conclusion The precision, accuracy, LLD, cut-off value and range of linearity of the candidate quantitative ELISA kit for anti-dsDNA antibody were consistent with the statement of the manufacturer, which indicated the performance of the kits may meet the requirements of clinic diagnosis and treatment. A series of methods used in this study provided a simple protocol for verifying the performance of quantitative ELISA kits.

anti-dsDNA antibody; enzyme-linked immunosorbent assay; verification for performance

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.15

广东省省级科技计划项目(2015A050502033)。

周晖，1969年生，女，主任技师，硕士，从事临床免疫学检验工作。

侯铁英，主任医师，硕士，E-mail：houtieying001@126.com。

R446.6

A

2017-05-03)