表皮松解性掌跖角皮症一家系KRT9基因新突变

曾 荣 何艳艳 惠 云 李志量 徐浩翔 李 岷

·论著·

表皮松解性掌跖角皮症一家系KRT9基因新突变

曾 荣1何艳艳1惠 云2李志量1徐浩翔1李 岷1

目的：检测表皮松解性掌跖角皮症一家系患者角蛋白9(KRT9)基因突变。方法：收集家系成员的临床资料和血样，提取家系中4例患者和3名正常人及50名与本家系无关的正常对照外周血DNA,采用PCR技术扩增KRT9基因所有编码区并进行测序，分别检测家系中的突变情况。结果：该家系中所有患者均存在KRT9基因错义突变(c.484T>C)，导致第162位密码子由TCT(丝氨酸)转变为CCT(脯氨酸)(p.S162P)，家系中3名正常个体和50名健康对照均未发现上述突变。结论：KRT9基因c.484T>C错义突变是导致该家系发生表皮松解性掌跖角皮症的遗传基础。

表皮松解性掌跖角皮症； KRT9基因； 基因突变

表皮松解性掌跖角皮症(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK)是一种相对常见的常染色体显性遗传性皮肤病[1]，不同人种均可出现本病，在北爱尔兰人群中其患病率是4.4/100 000[2]。EPPK主要临床特征为发病初期掌跖部位皮肤发红，然后发生肥厚的黄色角化过度，逐渐扩展累及手足侧面，皮损表面可以平滑呈蜡状，也可呈不规则状或疣状，皮肤病理可见表皮松解性角化过度。

1901年，Vorner首次报道了该病是一种常染色体显性遗传性疾病，1992年Reis等[3]通过遗传连锁分析后将EPPK的候选基因定位于染色体17q12-q21。1993年，Langbein等[4]首先报道角蛋白9突变是本病的致病基因。目前为止，不同研究者已在多个家系或散发病例中发现了包括错义突变、缺失突变等近30种不同的KRT9突变。本研究通过对1个中国汉族EPPK家系的KRT9基因进行检测，发现了1个新的错义突变。

1 对象与方法

1.1 对象 对家系中4代人进行调查，共有患者5例，其中男4例，女1例(图1)，均在出生后4周左右无明显诱因开始发病。先证者(IV4)为男性，3岁，出生后1个月开始双手手指及双足出现红斑，继而皮肤逐渐粗糙、增厚，随着年龄增长皮损泛发至整个手掌、足跖，表现为境界清楚的弥漫性角化过度性斑块，皮损表面呈疣状增生(图2)。患儿为足月顺产，父母否认近亲结婚，家系中其他患者可见类似皮损。

图1 家系图

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 获得知情同意后，分别采集家系成员静脉血各3 mL，其中患者4例和非患者3人；同时提取50名与本家系无关的正常人DNA作为对照。采用美国Promega公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 引物设计 选择在EPPK致病基因KRT9突变热点外显子1区域设计引物，引物序列为：上游引物：5'-TTGGCTACAGCTACGGCGGAGGAT-3'，下游引物：5'-TGGTCCTTGAGATCATCAATAGTG-3'。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 94℃预变性5 min后，94℃变性1 min，56℃～62℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35个循环。72℃延伸2 min，最后延伸5 min。扩增结束后用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。PCR产物经过纯化后直接在ABI 377型全自动测序仪(美国Applied Biosystem公司)上测序，所有测序结果与NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库进行分析比对。

图2 患者掌跖部位皮损。双手足掌跖部位弥漫性对称性皮肤增厚，表面轻度脱屑，部分区域皮损表面呈蜡状平滑。a，b为先证者；c为先证者父亲(III7)

2 结果

以家系中4例患者和3名非患者的基因组DNA为模板，利用设计的引物扩增出的产物，产物纯化后测序，将患者全部外显子直接测序结果与上述数据库中所公布的序列进行比对。结果发现，该家系中所有患者KRT9基因第一个外显子第484位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶(c.484T>C)，导致密码子出现TCT(丝氨酸)→CCT(脯氨酸)的改变，使得第162位氨基酸从丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)(p.S162P)(图3)，家系中非患者以及50名无亲缘关系的正常人对照未见该改变。

3 讨论

掌跖角皮症是以手掌/足跖部位出现角化过度性斑块为特征的一组疾病，其中表皮松解性掌跖角皮症(EPPK)最常见，主要特征包括：(1)掌跖部位弥漫性角化性斑块，境界清楚，有红色边缘，表面光滑呈黄色，伴有皲裂、脱屑等；(2)多在出生后数月发病，持续终生；(3)组织病理示表皮角化过度、颗粒层增厚、棘层和颗粒层有较多裂隙，裂隙处细胞界限不清，有淡染的物质或透明角质颗粒组织，可见表皮松解；(4)有家族史，呈常染色体显性遗传。我们所采集的这个家系，尽管没有皮损的病理学证据，但是，结合先证者和该家系中其他患者的表现以及疾病遗传方式，可诊断EPPK，目前体内外实验均已证实，该病的发生与KRT9基因突变相关。

a：先证者；b：正常对照。箭头所指处为突变点图3 KRT9基因测序图

人类KRT9基因相对分子量约为62 kDa，全长4492 kb，含8个外显子和7个内含子，其cDNA全长2353 bp，其基因结构包括一个氨基酸末端的头功能区域、一个羧基尾功能区域和中间由高度保守序列构成的棒状结构，其中棒状结构功能域由4个α-螺旋序列片段(1A、2A、1B、2B)和3个非螺旋连接片段(L1、L12、L3)组成[5]。我们对上述家系研究发现，KRT9基因的第一个外显子第484位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶(c.484T>C)，检索近年的文献发现，未见该位点出现相同突变的报道，而已发现的该病突变形式包括错义突变、插入突变、缺失突变等，这些突变大多存在于1A杆状区域头端和2B杆状尾端，这两个区域是目前发现的与EPPK相关的角蛋白热点突变区[6-8]，并有学者提出，这两个区域作为杆状结构的起始端和终末端可能直接参与角蛋白的组装相关，从而导致疾病发生，我们所报道的突变位点出现在热点突变区的1A杆状区域头端，引起氨基酸出现改变，可能影响了角蛋白的组装或功能，从而引发疾病。

迄今为止，关于EPPK家系中KRT9突变研究已经发现近30种，我们首次发现了该基因的1号外显子第484位胸腺嘧啶(T)突变为碱基胞嘧啶(C)的突变(c.484T>C)，该突变将导致第162位密码子由丝氨酸转变为脯氨酸(p.S162P)。脯氨酸(Pro)是非极性、疏水性氨基酸，而丝氨酸(Ser)是极性、中性氨基酸。这种氨基酸的变化将通过改变蛋白质构象影响其功能。我们的报道不是热点突变。目前p.R163W突变在多个家系中发现，被认为是热点突变[9-11]。我们的研究结果丰富了突变谱，这将有助于揭示角蛋白9的异常参与EPPK的发病机制，并可为患者的优生咨询提供依据。

[1] Itin PH, Lautenschlager S. Palmoplantar keratoderma and associated syndromes[J]. Semin Dermatol,1995,14(2):152-161.

[2] Covello SP, Irvine AD, McKenna KE, et al. Mutations in keratin K9 in kindreds with epidermolytic palmoplantar keratoderma and epidemiology in Northern Ireland[J]. J Invest Dermatol,1998,111(6):1207-1209.

[3] Reis A, Küster W, Eckardt R,et al. Mapping of a gene for epidermolytic palmoplantar keratoderma to the region of the acidic keratin gene cluster at 17q12-q21[J]. Hum Genet,1992,90(1-2):113-116.

[4] Langbein L, Heid HW, Moll I,et al. Molecular characterization of the body site-specific human epidermal cytokeratin 9: cDNA cloning, amino acid sequence, and tissue specificity of gene expression[J]. Differentiation,1993,55(1):57-71.

[5] Reis A, Hennies HC, Langbein L, et al. Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK)[J]. Nat Genet,1994,6(2):174-179.

[6] Liang YH, Liu QX, Huang L,et al. A recurrent p.M157R mutation of keratin 9 gene in a Chinese family with epidermolytic palmoplantar keratoderma and literature review[J]. Int J Dermatol,2014,53(8):e375-379.

[7] Chen N, Sun J, Song Y, et al. A novel mutation of KRT9 gene in a Chinese Han pedigree with epidermolytic palmoplantar keratoderma[J]. J Cosmet Dermatol,2016,[Epub ahead of print]

[8] 唐斌,潘小英,钟燕芳.表皮松解掌跖角化症KRT9基因突变的研究进展[J].皮肤性病诊疗学杂志,2014,21(06):505-508.

[9] Guo Y, Shi M, Tan ZP, et al. Possible anticipation in familial epidermolytic palmoplantar keratoderma with the p.R163W mutation of Keratin 9[J]. Genet Mol Res,2014,13(4):8089-8093.

[10] Liu WT, Ke HP, Zhao Y, et al. The most common mutation of KRT9, c.C487T (p.R163W), in epidermolytic palmoplantar keratoderma in two large Chinese pedigrees[J]. Anat Rec (Hoboken),2012,295(4):604-609.

[11] Wang P, Kang XJ, Tang XH, et al. Six generations of epidermolytic palmoplantar keratoderma, associated with a KRT9 R163W mutation[J]. Cancer Genetics,2016,209(11):515-524.

(收稿：2017-02-26 修回：2017-04-13)

Identification of a novel mutation of KRT9 gene in a family with epidermolytic palmoplantar keratoderma

ZENGRong1,HEYanyan1,HUIYun2,LIZhiliang1,XUHaoxiang1,LIMin1.

1.InstituteofDermatology，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,JiangsuKeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases&STDs,Nanjing210042,China; 2.DepartmentofDermatology,JinlingHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210002,China

s:XUHaoxiang,E-mail:xbpipi@163.comLIMin,E-mail:drlimin@sina.cn

Objective: To detect the mutation of keratin 9 gene (KRT9) in a family with epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK). Methods: Clinical data and blood samples of patients in the family were collected. Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the family members (including 4 patients and 3 unaffected members) and 50 healthy controls. All the exons of KRT9 gene and their flanking intronic sequences were amplified by PCR and direct sequencing was performed to screen the mutations in gene. Results: A missense mutation of c.484T>C was found in the patients, but absent in other 3 healthy members of the family and 50 unrelated healthy controls. Conclusion: The missense mutation of KRT9 gene (c.484T>C; p.S162P) is possible the molecular basis of pathogenesis of EPPK in this family.

Epidermolytic palmoplantar keratoderma; KRT9 gene; gene mutation

中国医学科学院重大疾病创新研究(编号：2016ZX320014) 北京协和医学院青年教师培养基金(编号：2015zlgc0749) 江苏省自然科学基金(编号：BK20150068) 国家自然科学基金(编号：81472905，81502739)

1中国医学科学院&北京协和医学院皮肤病研究所，江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室,江苏南京，210042 2南京军区总医院皮肤科，江苏南京，210002

徐浩翔, E-mail: xbpipi@163.com 李 岷, E-mail: drlimin@sina.cn