通络活血虫类药对乏氧环境下肺癌血管生成相关细胞因子的影响

李道睿，王苗苗，2，于明薇，林飞，张颖，李蒙，樊慧婷，郑琦，祁鑫，裴迎霞，张培彤，侯炜，林洪生

1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029；3.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010

通络活血虫类药对乏氧环境下肺癌血管生成相关细胞因子的影响

李道睿1，王苗苗1，2，于明薇3，林飞1，张颖1，李蒙1，樊慧婷1，郑琦1，祁鑫1，裴迎霞1，张培彤1，侯炜1，林洪生1

1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029；3.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010

目的观察通络活血虫类药（全蝎、蜈蚣、守宫）对乏氧环境下肺癌血管生成相关细胞因子的影响。方法 采用低氧工作站体外模拟肿瘤乏氧微环境培养A549肺癌细胞，加入不同浓度全蝎、蜈蚣、守宫药物血清，MTT法检测细胞增殖，筛选最佳药物浓度及作用时间。A549肺癌细胞经3种药物血清处理后，收集细胞培养上清液，ELISA检测上清液中血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量。结果 3种药物血清对常氧及乏氧培养的A549肺癌细胞增殖均有一定的抑制作用。最终筛选7.5%浓度药物血清、作用24 h进行后续实验。3种药物血清较对照组A549细胞VEGF、TGF-β1、bFGF含量均降低（P＜0.05，P＜0.01）。结论 3种虫类药在常氧和乏氧状态下均有抑制癌细胞和对血管生成相关细胞因子调控的作用。

通络活血；虫类药；肺癌；乏氧

肺癌是当今世界对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率居恶性肿瘤第1位。目前由于缺乏有效的治疗手段，不能很好地控制肺癌的转移，常常导致治疗的失败。因此，防止和阻断转移是肺癌治疗取得成功的关键。本课题组前期研究显示，肺癌转移的形成与肺癌患者普遍存在“络脉瘀滞”的现象有直接关系[1]，“络病”可能是肺癌发生转移的病机要点和关键环节，肿瘤乏氧微环境在这一过程中起着至关重要的作用。基于“虫蚁通络”理论，全蝎、蜈蚣、守宫等有通络活血作用的虫类药在临床中广泛应用于肺癌转移的防治中，其发挥作用的主要环节可能是改善肿瘤乏氧微环境。本研究采用低氧工作站培养肺癌A549细胞模拟肿瘤乏氧微环境，观察通络活血虫类药（全蝎、蜈蚣、守宫）药物血清对乏氧环境下肺癌血管生成相关细胞因子的干预作用，以期阐释虫类药在干预肺癌转移方面的具体作用靶点。

1 实验材料

1.1 动物

健康清洁级雌性Wistar大鼠40只，4周龄，体质量 230～250 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2006-0009。饲养于中国中医科学院广安门医院清洁级动物室，室温（20±3）℃、相对湿度 40%～60%，每日人工照明12 h，每笼4只，自由饮水摄食。

1.2 细胞株

高转移性人肺腺癌A549细胞株，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.3 药物及药物血清制备

全蝎、蜈蚣、守宫购自北京市本草方源医药公司，批号20141121，经中国中医科学院广安门医院张萱鉴定符合药典标准。将原药材粉碎成细粉，4 ℃保存备用，用前用无菌水稀释至所需浓度。全蝎、蜈蚣、守宫大鼠药物血清制备：按照临床患者用药剂量折算大鼠的生物等效剂量（全蝎、蜈蚣、守宫临床用药剂量分别按1、1、2.5 g计），制备中药水溶剂。实验大鼠采用随机数字表法随机分为4组，每组10只，分别予3种中药水溶液和生理盐水灌胃，连续3 d，前2 d每日2次，第3日给药1次后腹主动脉取血。末次给药1 h后2%异戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉后腹主动脉取血，室温静置2 h，3500 r/min离心20 min，分离分装血清，56 ℃灭活30 min，-80 ℃保存备用。

1.4 主要试剂与仪器

血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）试剂盒，MULTISCIENCE公司；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）试剂盒，ELABSCIENCE公司；噻唑蓝（MTT），Sigma公司；DMEM（SH30023），Hyclone公司；胎牛血清（FBS，SH30084），Hyclone公司；双抗（SV30010），Hyclone公司。CO2培养箱，Thermo公司；全波长酶标仪（Multiskan GO），Thermo公司；倒置显微镜（TS-100），Nicon公司；全自动多功能酶标仪（Multiskan MK3），Thermo公司；电热恒温培养箱，DH4000A，天津泰斯特；低氧工作站，Ruskinn公司。

2 实验方法

2.1 肺癌细胞常氧培养条件

A549细胞采用含10%FBS、抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的DMEM培养基，于37 ℃、21%O2和5%CO2培养箱中培养，1∶3～1∶5传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 肺癌细胞乏氧培养条件

A549细胞采用相同成分培养基，37 ℃、1%O2和5%CO2低氧工作站中培养。

2.3 分组

经预实验筛选后，本实验分为 48组。常氧对照组：细胞置于常氧条件下加入不同浓度大鼠血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h；乏氧对照组：细胞置于乏氧条件下加入不同浓度大鼠血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h；常氧全蝎组：细胞置于常氧条件下加入不同浓度全蝎药物血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h；乏氧全蝎组：细胞置于乏氧条件下加入不同浓度全蝎药物血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h；常氧蜈蚣组：细胞置于常氧条件下加入不同浓度蜈蚣药物血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h；乏氧蜈蚣组：细胞置于乏氧条件下加入不同浓度蜈蚣药物血清（5%、7.5%、10%）培养 24、48 h；常氧守宫组：细胞置于常氧条件下加入不同浓度守宫药物血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h；乏氧守宫组：细胞置于乏氧条件下加入不同浓度守宫药物血清（5%、7.5%、10%）培养24、48 h。

2.4 细胞增殖检测（药物最佳剂量和作用时间筛选）

称取MTT粉250 mg，溶于50 mL PBS，混匀，终浓度5 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，700 μL/支分装，-20 ℃避光保存。取对数生长期的 A549细胞，常规消化，制成单细胞混悬液，调整细胞数为1×104/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，常规培养过夜，分别加入不同浓度全蝎、蜈蚣、守宫药物血清（5%、7.5%、10%）及相应浓度大鼠血清作为对照组，每组设6个复孔，继续培养24、48 h，培养结束前4 h每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，继续培养4 h后弃培养基，每孔加入150 μL DMSO，充分混匀，于酶标仪波长490 nm处测定吸光度（A），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）＝（1－A给药组÷A对照组）× 100%。

2.5 细胞因子检测

A549细胞分别在常氧和乏氧条件下经MTT筛选的最佳作用浓度和时间处理后，收集细胞培养上清液，每组设 6个复孔，ELISA检测细胞培养上清VEGF、TGF-β、bFGF的含量。严格按照试剂盒说明书进行检测。

3 统计学方法

4 结果

4.1 不同浓度药物血清对A549肺癌细胞增殖的影响

3种中药药物血清对常氧及乏氧培养A549肺癌细胞增殖均有抑制作用，其中 7.5%浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；同时药物作用24、48 h细胞增殖抑制率未见明显差异，见表1、表2。故最终筛选7.5%浓度药物血清、干预24 h，进行后续实验。

表1 常氧及乏氧环境培养24 h MTT法检测结果（±s，n＝6）

表1 常氧及乏氧环境培养24 h MTT法检测结果（±s，n＝6）

注：与同一浓度大鼠血清对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 常氧 乏氧A值 抑制率/% A值 抑制率/% 5%大鼠血清对照组 0.345±0.034 0.435±0.079 5%全蝎血清组 0.288±0.044 16.54 0.418±0.091 3.82 5%蜈蚣血清组 0.282±0.046* 18.45 0.377±0.014 13.21 5%守宫血清组 0.265±0.030** 23.18 0.368±0.026 15.37 7.5%大鼠血清对照组 0.533±0.040 0.466±0.052 7.5%全蝎血清组 0.443±0.045** 16.79 0.376±0.040** 19.20 7.5%蜈蚣血清组 0.399±0.024** 25.05 0.357±0.028** 23.32 7.5%守宫血清组 0.379±0.035** 28.84 0.345±0.042** 25.92 10%大鼠血清对照组 0.410±0.094 0.430±0.094 10%全蝎血清组 0.333±0.041 18.70 0.350±0.063 18.70 10%蜈蚣血清组 0.308±0.034* 24.76 0.332±0.039 22.91 10%守宫血清组 0.298±0.038* 27.17 0.323±0.054* 24.98

表2 常氧及乏氧环境培养48 h MTT法检测结果（±s，n＝6）

表2 常氧及乏氧环境培养48 h MTT法检测结果（±s，n＝6）

注：与同一浓度大鼠血清对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别常氧 乏氧A值 抑制率/ % A值 抑制率/ % 5 %大鼠血清对照组 0 . 7 3 8 ± 0 . 1 5 2 0 . 7 4 9 ± 0 . 0 4 9 5 %全蝎血清组 0 . 6 5 8 ± 0 . 1 2 2 1 0 . 9 4 0 . 7 1 1 ± 0 . 0 4 8 5 . 0 0 5 %蜈蚣血清组 0 . 6 3 1 ± 0 . 0 3 5 1 4 . 5 5 0 . 6 5 2 ± 0 . 0 4 4* 1 2 . 9 2 5 %守宫血清组 0 . 6 1 6 ± 0 . 1 1 5 1 6 . 5 8 0 . 6 4 6 ± 0 . 0 5 3** 1 3 . 7 2 7 . 5 %大鼠血清对照组 1 . 1 0 4 ± 0 . 0 8 5 0 . 7 6 0 ± 0 . 1 2 6 7 . 5 %全蝎血清组 0 . 9 0 5 ± 0 . 1 0 4** 1 8 . 0 7 0 . 6 1 5 ± 0 . 0 3 0* 1 9 . 0 2 7 . 5 %蜈蚣血清组 0 . 8 3 7 ± 0 . 0 8 2** 2 4 . 1 6 0 . 5 8 4 ± 0 . 0 6 0** 2 3 . 0 7 7 . 5 %守宫血清组 0 . 8 0 3 ± 0 . 0 7 7** 2 7 . 2 4 0 . 5 6 8 ± 0 . 0 3 2** 2 5 . 1 8 1 0 %大鼠血清对照组 0 . 9 3 5 ± 0 . 1 2 4 0 . 6 6 0 ± 0 . 1 3 5 1 0 %全蝎血清组 0 . 7 7 5 ± 0 . 0 8 3 1 7 . 0 9 0 . 5 3 0 ± 0 . 0 9 3 1 9 . 6 8 1 0 %蜈蚣血清组 0 . 7 0 3 ± 0 . 1 0 7** 2 4 . 8 1 0 . 5 0 0 ± 0 . 0 6 3 2 4 . 2 2 1 0 %守宫血清组 0 . 6 9 4 ± 0 . 0 9 2** 2 5 . 7 5 0 . 4 9 6 ± 0 . 1 0 1* 2 4 . 9 2

4.2 不同浓度药物血清对A549肺癌细胞血管生成相关细胞因子的影响

选取7.5%浓度药物血清作用A549细胞24 h后，全蝎组、蜈蚣组、守宫组A549细胞VEGF、TGF-β1、bFGF含量降低，且该作用在常氧和乏氧状态下相同。见表3。

表3 各组细胞上清液相关细胞因子水平比较（±s，pg/mL）

表3 各组细胞上清液相关细胞因子水平比较（±s，pg/mL）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 n常氧b F G F T G F -β 1 V E G F对照组 6 2 6 4 . 6 4 ± 2 3 . 5 4 2 9 7 9 . 9 1 ± 4 0 6 . 9 1 1 0 2 . 7 4 ± 2 2 . 2 1 3 1 9 . 3 0 ± 3 2 . 6 6 3 5 6 5 . 6 5 ± 3 7 2 . 1 1 1 2 1 . 3 4 ± 2 3 . 0 3乏氧 b F G F T G F -β 1 V E G F全蝎组 6 2 1 1 . 1 5 ± 3 0 . 8 4* 2 4 2 2 . 4 4 ± 3 1 8 . 5 7* 5 9 . 9 0 ± 2 1 . 0 3* 2 5 3 . 0 2 ± 4 3 . 2 6* 2 7 4 2 . 7 9 ± 4 8 3 . 6 1* 8 2 . 7 5 ± 2 2 . 1 1*蜈蚣组 6 2 1 4 . 2 9 ± 3 4 . 3 9* 2 3 4 4 . 8 0 ± 3 1 0 . 4 6* 5 8 . 1 4 ± 2 4 . 0 1* 2 5 4 . 1 1 ± 4 9 . 0 8* 2 7 3 8 . 3 3 ± 5 3 8 . 5 2* 7 8 . 9 7 ± 2 3 . 1 7*守宫组 6 2 0 9 . 3 8 ± 2 8 . 8 0* 2 3 6 1 . 4 5 ± 2 9 9 . 0 1* 5 5 . 4 1 ± 2 2 . 7 5** 2 3 8 . 4 6 ± 4 3 . 4 3** 2 6 9 1 . 7 2 ± 5 4 8 . 8 0* 6 9 . 2 2 ± 2 6 . 6 6**

5 讨论

乏氧是实体肿瘤中较常见的现象，肿瘤细胞处于乏氧微环境时，可通过多种细胞机制调节使癌细胞适应这种不利的环境，进而使肿瘤细胞更具有抵抗力和生存的能力。这种适应性的改变不仅使肿瘤自身更具侵袭性，容易发生远处转移，而且能使肿瘤对非手术治疗的抗拒性增加，降低肿瘤治疗的疗效。络脉是经脉向脏腑肢节渗灌气血与气机气化的主要场所，亦为外邪入侵之门径。结合现代医学的认识，肺癌“络病”有着明确的现代生物学基础，肺癌络病可能是中医学肺癌发生与转移机制的中心环节[2]。肺气亏虚，五脏之毒亦可通过经络传舍于肺，混处肺络，留而成积，导致肺癌的发生。气为血之帅，气行则血行，气机不畅，血行代谢障碍，瘀久而成肿块；痰湿、邪毒结于脏腑经络，无处不到，同时亦可能以络脉系统为通路，发生侵袭与转移。因此，我们认为肿瘤乏氧微环境导致瘤转移与肺癌“络脉瘀滞”理论有很强的相关性。

中医学认为虫类药乃血肉有情之品，以咸味、辛味居多，气温或平，且多有小毒。辛味“能散，能行”，加之性温，多能通，可消除壅滞；咸以入血、软坚散结，故《素问•宣明五气篇》有“咸走血”，又以取类比象法，认为虫类药性善走窜，剔邪搜络，攻坚破积；吴鞠通言：“以食血之虫，飞者走络中气分，走者走络中血分，可谓无微不入，无坚不破。”今人治肿瘤常常选择虫类药，皆利用其走窜善行之特点，搜剔血络。全蝎，辛、咸、平、有毒，为钳蝎科动物钳蝎的干燥全虫；蜈蚣，辛、温、有毒，为大蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣或其近缘动物的干燥全虫；守宫（又称壁虎、蝎虎、天龙等），咸、寒、有小毒，为壁虎科动物无蹼壁虎的全体。三者性喜走窜，内入脏腑，外达经络，均具有通络活血散结之效，在临床肿瘤治疗中常配伍应用，在一些基础实验中也初步发现此3种中药具有抑制肿瘤转移及抗肿瘤血管新生的作用[3-5]，故本实验选取上述中药作为通络活血虫类药代表药，研究其对肺癌“络脉瘀滞”干预的深入作用机理。

在既往的研究中，我们采用Ruskinn低氧工作站体外模拟肺癌乏氧环境取得了很好的效果。我们将人肺癌PG细胞分别置于常氧环境、低氧环境传代培养，发现适度的缺氧肺癌细胞增殖明显增加，并有利于细胞的侵袭[6]。血管生成是肿瘤发生和转移的基本条件之一。肿瘤生长迅速，现有血管难以满足肿瘤对氧气和营养的需求，缺氧诱导肿瘤微环境中 VEGF、TGF-β1、bFGF等细胞因子的含量增加[7-9]，进而刺激肿瘤血管新生及转移的发生。

本研究结果显示，全蝎、蜈蚣、守宫药物血清对常氧及乏氧培养的A549肺癌细胞增殖均有一定的抑制作用。3种中药药物血清可降低A549细胞VEGF、TGF-β1、bFGF的含量。3种虫类药在常氧和乏氧状态下均具有抑制癌细胞和对血管生成相关细胞因子的调控作用，显示此类中药对肿瘤独特的作用特点。本实验初步证明了对血管生成相关细胞因子的调控是通络活血虫类药改善肿瘤乏氧及转移的具体作用靶点之一。但由于该类中药成分和乏氧肿瘤微环境的复杂性，今后还需要进行更加深入的研究。

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Effects of Dredging Collaterals and Activating Blood Worm Chinese Materia Medica on Angiogenesis Related Factors of Lung Cancer in Hypoxic Environment

LI Dao-rui1, WANG Miao-miao1,2, YU Ming-wei3, LIN Fei1, ZHANG Ying1, LI Meng1, FAN Hui-ting1, ZHENG Qi1, QI Xin1, PEI Ying-xia1, ZHANG Pei-tong1, HOU Wei1, LIN Hong-sheng1(1. Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinses Medical Sciences, Beijing 100053, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 3. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100010, China)

ObjectiveTo observe the effects of dredging collaterals and activating blood worm Chinese materia medica on angiogenesis related factors of lung cancer in hypoxic environment. Methods The lung cancer A549 cells were cultured in vitro to simulate tumor hypoxia microenvironment by the hypoxia workstation, and different concentrations of Scorpio, Scolopendra and Gecko medicated serum were added. MTT method was used to detect cell proliferation and screen the best medicine concentration and duration of action. Lung cancer A549 cells were administrated by the three kinds of medicated serum, and cells were collected and supernatant was cultured. Contents of VEGF, TGF-β1, and bFGF were detected by ELISA. Results Three kinds of medicated serum had the inhibitory effect on both added normoxia and hypoxia in cultured A549 lung cancer cells. 7.5% concentration of medicated serum was selected, and 24 h later were used in later experiments. Scorpio, Scolopendra and Gecko medicated serum can more reduce the contents of VEGF, TGF-β1 and bFGF in the supernatant of A549 cell compared with the control group (P＜0.05, P＜0.01). Conclusion Dredging collaterals and activating blood worm Chinese materia medica had inhibitory effect on cancer cells and the regulation of angiogenesis related cytokines in the condition of normoxia and hypoxia.

dredging collaterals and activating blood; worm Chinese materia medica; lung cancer; hypoxia

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.010

R285.5

A

1005-5304(2017)09-0039-04

2017-03-10）

（

2017-03-31；编辑：华强）

国家自然科学基金（81302963）

林洪生，E-mail：dr.linhongsheng@163.com