聚酰胺树脂分离纯化神香草提取液工艺研究

毛艳，贺金华，王新堂，戎晓娟

新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004

聚酰胺树脂分离纯化神香草提取液工艺研究

毛艳，贺金华，王新堂，戎晓娟

新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004

目的考察聚酰胺树脂分离纯化神香草提取液的最佳工艺条件。方法 以总黄酮和迷迭香酸为检测指标，采用单因素考察法筛选树脂纯化工艺中的最大上样量、水洗脱体积、洗脱剂用量、上样液浓度、树脂吸附时间、上样液pH值和洗脱速率等参数。结果 最佳纯化工艺参数为：神香草提取液浓度为10 mg/mL，最大上样量为12 mL，水洗脱2 BV去除杂质，40%乙醇洗脱9 BV，上样液迷迭香酸浓度86.3 μg/mL、总黄酮浓度117.8 μg/mL左右，树脂吸附时间为14 h，上样液pH值调至6.5，洗脱速度3.0 BV/h。结论 该方法简便易行，分离效果良好，适用于神香草提取液的分离纯化。

神香草；聚酰胺树脂；总黄酮；迷迭香酸；纯化工艺

神香草为唇形科植物硬尖神香草 Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分，维吾尔名为“祖发奇尼”，是维吾尔族民间习用药材[1]，性质干热，有很强的香味，具有镇咳、袪痰、平喘作用，作为维吾尔医和民间用药已有几百年历史，疗效显著。以神香草为主药的寒喘祖帕颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准.维吾尔药分册》1999年版，在新疆维吾尔医院临床用于治疗哮喘具有很好的疗效。

神香草含有黄酮类、多糖及苷、酚酸类、甾醇类、萜类化合物以及醛类、脂类、有机酸[2-4]等。近年来，随着分离纯化技术的进步，对神香草的化学成分有了新的认识。赵军等[5]报道，神香草中含有大量黄酮类化合物，具有抗炎、抗过敏及抑制细菌的作用。迷迭香酸是神香草药材中质量分数较高的成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血栓和抑制透明质酸酶等多种生物活性[6]。

本课题前期神香草抗哮喘有效部位谱效学实验显示，神香草具有很好的抗哮喘作用，且初步确定了其活性有效部位[7]。目前尚未见采用聚酰胺吸附树脂处理、纯化神香草抗哮喘有效部位的报道。因此，本试验以迷迭香酸和总黄酮含量为指标，研究神香草抗哮喘有效部位的聚酰胺分离纯化工艺，优选最佳工艺参数，为神香草抗哮喘有效部位纯化的中试和工业化大生产提供可靠依据，也为神香草的制剂研究奠定基础。

1 仪器与试药

UltiMate 3000系列高效液相色谱仪（包括二极管阵列检测器、四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、4～40 ℃恒温箱），美国 Thermo Scientific Technologies公司；UV-2501PC型紫外分光光度计，日本岛津；DT500A型电子计数天平，常熟市金羊砝码仪器有限公司金羊天平仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；BP211D型电子天平，德国 Sartorius；RE-2000A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

迷迭香酸对照品（批号 111871-201203，纯度98.6%）、芦丁（批号110885-200102）、木犀草素（批号111520-200504），中国食品药品检定研究院；三裂鼠尾草素（批号MUST-15052611，纯度99.17%），成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher），其他试剂均为分析纯。

野生神香草药材于2014年8月采自新疆阿尔泰地区，由本所何江副研究员鉴定为唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 指标性成分检测方法

2.1.1 紫外分光光度法测定总黄酮

2.1.1.1 对照品溶液的制备 取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含195.4 µg的溶液，即得。

2.1.1.2 线性关系 精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL置25 mL量瓶中[8]，加无水乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加无水乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法[2015年版《中华人民共和国药典》（一部）附录0401]，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝0.013 4X－0.006 3，r＝0.999。结果表明，总黄酮在11.72～46.90 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.2 HPLC测定迷迭香酸

2.1.2.1 对照品溶液的制备 取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含191.3 µg的溶液，即得。

2.1.2.2 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-0.1%甲酸（23∶77），检测波长为330 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃。

2.1.2.3 标准曲线 精密吸取迷迭香酸对照品溶液0.15、0.5、1、2、4、6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以迷迭香酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝0.370 5X－0.079 3，r＝1。结果表明，迷迭香酸在2.87～114.78 μg/mL范围内线性关系良好。色谱图见图1。

图1 神香草提取液中迷迭香酸HPLC图

2.2 聚酰胺树脂分离纯化工艺

2.2.1 聚酰胺树脂预处理 将聚酰胺树脂置于圆底烧瓶中，用95%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，然后将树脂倒出并抽滤，在吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4～0.5倍乙醇，然后将聚酰胺树脂投入吸附柱中，使其液面至高于树脂约0.3 cm处，然后用2 BV/h乙醇淋洗树脂（应将树脂中的气体排出），并用蒸馏水以同样流速洗净乙醇，直到流出液没有醇味，备用。

2.2.2 上柱药液的制备 取神香草药材粗粉适量，加入16倍量50%乙醇，提取3次，每次1 h，提取液浓缩至无醇味，然后加入适量的蒸馏水，搅拌均匀，过滤，制成适宜质量浓度的神香草提取液（含原药材48 mg/mL，其中迷迭香酸浓度9.13 μg/mL、总黄酮浓度117.8 μg/mL）后备用。

2.2.3 最大上样量考察 取处理好的聚酰胺树脂3 g于1.5 cm×30 cm层析柱内，精密吸取上样液，以1 BV/h流速进行动态吸附，分段收集流出液，每4 mL收集1份，收集6份后，每8 mL收集1份，用水定容至10 mL容量瓶中，共收集19份。每份流出液依法测定迷迭香酸和总黄酮含量，绘制泄漏曲线，见图2。可见，第4份收集样即第16 mL时，总黄酮开始明显泄漏（总黄酮泄漏率 6.39%），故确定最大上样体积为12 mL上样液。

图2 上样量对动态吸附泄漏率的影响

2.2.4 水洗脱体积及洗脱终点考察 课题组前期进行的神香草抗哮喘有效部位谱效学研究结果显示，40%乙醇洗脱部位抗哮喘效果最好，所以本试验进一步考察水洗脱柱体积和洗脱终点。

取处理好的聚酰胺树脂 3 g，湿法装柱后上样12 mL，以1 BV/h流速进行动态吸附，先后用2 BV水、3 BV 20%乙醇、5 BV 40%乙醇、5 BV 60%乙醇洗脱，每1 BV为1份样品，分别计算各BV的吸附率和解吸率。吸附率（%）＝（C0V0－C1Vl）/C0V0× 100%，解吸率（%）＝C2V2/（C0V0－C1Vl）×100%。C0为神香草提取液中指标成分的质量浓度，V0为神香草提取液体积，C1为残液中指标成分的质量浓度，V1为残液体积，C2为洗脱液中指标成分的质量浓度，V2为洗脱液体积。结果见表1。

表1 水洗脱体积及洗脱终点考察结果（%）

由表1可知，目标洗脱部位40%乙醇洗脱液中，迷迭香酸的吸附率＝100%、解吸率＜50%，还需继续考察 40%乙醇洗脱体积；水洗脱液中含有大量总黄酮，随着水用量的增加，总黄酮损失率逐渐增加，综合考虑，确定水用量为2 BV。

2.2.5 40%乙醇洗脱柱体积考察 取处理好的聚酰胺树脂3 g，湿法装柱后上样12 mL，以1 BV/h流速进行动态吸附，依次用2 BV水、3 BV 20%乙醇、11 BV 40%乙醇洗脱，分段收集流出液，每1 BV为一流份，依法检测样品中迷迭香酸、总黄酮的吸附率和解吸率，结果见表2。

表2 40%乙醇洗脱终点考察结果（%）

由表2可知，40%乙醇洗脱部位中迷迭香酸和总黄酮主要集中在前7个柱体积中，综合时间因素和生产成本，最终决定收集9个洗脱柱体积。

2.2.6 上样液浓度考察 取经预处理好的聚酰胺树脂3 g，平行取5份，湿法装柱。取上样液12 mL，其中后4份分别加入一定量的蒸馏水，稀释至质量浓度分别为16、20、24、32 mL，以1 BV/h吸附流速加于层析柱上，先用2 BV水洗脱后，再用3 BV 20%乙醇和9 BV 70%乙醇洗脱，分段收集流出液，每1 BV为一流份，依法检测样品中迷迭香酸和总黄酮的解吸率，结果见图3。综合考虑迷迭香酸和总黄酮的解吸率结果，最终选定上样液12 mL，即迷迭香酸浓度为86.3 μg/mL、总黄酮浓度为117.8 μg/mL。

图3 上样液浓度对解吸率的影响

2.2.7 吸附时间考察 取处理好的聚酰胺树脂3 g，平行4份，湿法装柱后上样12 mL，分别考察吸附时间0、2、4、14 h对迷迭香酸和总黄酮解吸率的影响，上样量及洗脱量按前述确定，其余条件同前，结果见图4。可见，上样液吸附14 h，迷迭香酸和总黄酮解吸率均较高。

2.2.8 上样液pH值考察 取处理好的聚酰胺树脂3 g（柱体积19 mL）于1.5 cm×30 cm层析柱内，平行5份，上样液用1 mol/L盐酸和1 mol/L NaOH溶液分别调至pH值为3、4.5、5.5、6.5、8，上样12 mL，静置过夜后，分别考察洗脱液对迷迭香酸、总黄酮解吸率的影响，上样量及洗脱量按前述确定，其余条件同前，结果见图5。可见，总黄酮解吸率在pH＝3时最高，但迷迭香酸完全未解吸，当上样液调pH＝6.5时迷迭香酸和总黄酮解吸率均较高。

2.2.9 洗脱速率考察 取处理好的聚酰胺树脂3 g，平行4份，湿法装柱，上样液用1 mol/L NaOH溶液调pH 6.5，上样12 mL，静置过夜后，分别考察洗脱速度为1、2、3、4 BV/h对迷迭香酸、总黄酮解吸率的影响，上样量及洗脱量按前述确定，其余条件同前，结果见图6。可见，随着流速的升高，迷迭香酸和总黄酮的解吸率逐渐降低，综合考虑时间和经济成本，最终决定选用洗脱流速为3 BV/h。

图4 吸附时间对解吸率的影响

图5 上样液pH值对解吸率的影响

图6 洗脱速率对解吸率的影响

2.2.10 验证试验 取经处理好的聚酰胺树脂3 g，平行3份，湿法装柱，取质量浓度为10 mg/mL的神香草提取液12 mL上柱，按上述纯化工艺进行3次验证试验，收集40%乙醇洗脱液，按“2.1.1”和“2.1.2”项下方法测定 40%乙醇洗脱液中迷迭香酸和总黄酮含量并计算。结果迷迭香酸的解吸率分别为72.23%、69.84%、71.17%，平均为 71.08%；总黄酮的解吸率为97.89%、98.99%、97.56%，平均为98.15%。表明该纯化工艺重复性良好，所选工艺稳定可行。

3 讨论

聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基，可与多酚类化合物的酚羟基形成氢键结合而被吸附，化合物分子中酚羟基数目越多吸附力越强；黄酮类化合物结构中的羟基和糖苷键等极性基团，易于与聚酰胺形成氢键而被吸附[9]，且聚酰胺树脂颗粒具有再生性好、选择性高、操作简便、解吸速度快的特点。因此，我们选择聚酰胺吸附树脂进行神香草中的黄酮类和酚类化合物的分离。

本课题组前期采用体外细胞培养技术检测神香草不同极性提取物和纯化物的体外抗炎活性，初步将HPLC指纹图谱和体外药效实验结果相结合，采用灰色关联度统计分析方法对谱效关系进行了研究，考察神香草不同极性提取物和纯化物HPLC指纹图谱特征峰对体外炎症因子和抗肿瘤坏死因子抑制作用的相关性，通过“谱效”关系研究阐明神香草抗炎作用的药效物质基础，进一步得到神香草抗哮喘有效部位，为后期深度开发和利用神香草提供理论依据[7]。

本试验结果表明，最佳纯化工艺参数为：聚酰胺树脂分离纯化，上样液中迷迭香酸浓度为86.3 µg/mL、总黄酮浓度为117.8 µg/mL左右，上样液调pH值至6.5，吸附时间为14 h，吸附速度为1.0 BV/h，洗脱速度为3.0 BV/h，水洗脱2 BV去除杂质，20%乙醇洗脱3 BV，40%乙醇洗脱9 BV。40%乙醇洗脱液蒸干后测定干浸膏质量，其中总黄酮和迷迭香酸的质量分数分别达到35.1%和3.7%以上。该工艺操作简单、重复性好，可作为分离纯化神香草提取液的有效方法，对后期研究依从性较好的神香草新制剂工艺有一定的应用价值。

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Research on Separation and Purification of Extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. with Polyamide Resins

MAO Yan, HE Jin-hua, WANG Xin-tang, RONG Xiao-juan (Xinjiang Institute of MateriaMedica, Urumqi 830004, China)

ObjectiveTo investigate the optimal process conditions for the separation and purification of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. by polyamide resins. Methods The total flavonoids and rosmarinic acid were used as the indexes. The maximum amount of sample solution, elution volume, concentration of sample solution, adsorption time of resin, loading time of sample solution and the amount of eluting solvent, pH and elution rate in the resin purification process were screened by single factor method. Results The optimal purification parameters were as follows: 10 mg/mL of extract, 12 mL of sample amount, 2 BV of water to remove impurities, 40% ethanol to elute 9 BV; the concentration of rosmarinic acid in sample solution was 86.3 μg/mL, and the total flavonoid concentration was 117.8 μg/mL; the resin adsorption time was 14 h; the pH of sample solution was 6.5; the elution rate was 3.0 BV/h. Conclusion This method is simple and feasible, fit for separating and purifying of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss.

Hyssopus cuspidatus Boriss.; polyamide resins; total flavonoid; rosmarinic acid; purification process

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.016

R284.2

A

1005-5304(2017)09-0063-05

2017-02-13）

（

2017-03-20；编辑：陈静）

新疆维吾尔自治区科技计划项目（201417107）

贺金华，E-mail：hejh1216@163.com