多肽固相合成中2-CTC树脂首位氨基酸连接效率影响因素的研究

(大连民族学院 生物技术与资源利用 教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)

多肽固相合成中2-CTC树脂首位氨基酸连接效率影响因素的研究

李容庆，张丽影 ，于 洋，蓝浩铭，曲 宁

(大连民族学院 生物技术与资源利用 教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)

采用五种结构差异较大的Fomc保护氨基酸分别与2-氯三苯甲基氯树脂进行缩合反应，通过考察最终产物氨基酸取代度的差异探讨影响2-CTC树脂首个氨基酸连接效率的因素。结果表明，保护氨基酸的位阻效应对于连接反应的影响占首位；当氨基酸结构类似时，氨基酸分子中取代基的诱导效应对树脂取代度的影响更强。

2-氯三苯甲基氯树脂；Fomc-aa-CTC；取代度

多肽固相合成法(Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS)因具有操作简便，副产物少，易于纯化等优点，自创立以来被广泛应用到多肽的合成研究中，尤其是可作为药物使用的短肽的实际生产[1-3]。在固相合成过程中，载体树脂的结构及性能对肽链之间的聚集及缩合反应的进行影响巨大，进而影响目标肽的产率和纯度。目前肽固相合成中最常用的树脂有Wang 树脂、HMBA-AM树脂、PAM树脂和2-氯三苯甲基(2-CTC)树脂等。2-CTC树脂因能有效抑制外消旋及二酮哌嗪生成等副反应的发生[4-6]、反应条件较其他树脂更为温和以及产物纯度高等，目前已逐步成为多种多肽药物工业化生产的载体[7]。当采用2-CTC树脂作为载体合成肽时，首位Fomc保护的氨基酸与树脂的连接效率直接影响到后续保护氨基酸的用量以及最终目标肽的产率。因此，本论文选择五种不同结构的Fomc保护氨基酸与2-CTC树脂进行取代反应，考察了树脂的溶胀情况及保护氨基酸的结构对最终2-CTC树脂取代度的影响，为今后以2-CTC为载体固相合成多肽提供一些理论支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

红外光谱分析：美国IR Prestige-21型红外光谱仪，KBr压片法；紫外分光光度计：日本岛津UV-2450型紫外光谱仪。

2-氯三苯甲基氯树脂(2-CTC树脂)，Fomc-Gly-OH，Fomc-Tyr-OH，Fomc-Phe-OH，Fomc-His(Trt)-OH，Fomc-Asp(OtBu)-OH，吉尔生化(上海)有限公司；N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，上海阿拉丁试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、无水甲醇、乙醇均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；哌啶，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Fmoc-aa-CTC树脂的制备

树脂溶胀：取1mmol 2-CTC树脂倾入反应容器内，DCM溶胀一定时间，随后用20mL DMF洗涤3次，每次2min，抽干。

首位氨基酸的连接：将2mmol Fmoc保护的氨基酸，冰浴条件下溶解在DMF中的DIEA(2mL/12mmol)溶液分别加入反应器其中，室温下氮气吹扫反应2h，随后用20ml DMF洗涤3次，每次2min。制得Fmoc-aa-CTC。

封闭未反应位点：用20mL DCM: 甲醇: DIEA=80: 15: 5的溶液洗涤树脂2次，每次10min。用无水甲醇(10mL)洗涤3次，每次2min。室温减压干燥至恒重。

1.2.2 Fmoc氨基酸连接CTC树脂的替代度检测

称取干燥恒重的Fmoc-aa-CTC，2份各10.0mg，分别置于1.5mL的离心管中。向离心管中加入1mL，20%的哌啶/DMF溶液。室温震荡20min，脱去Fmoc保护基。取200μL上清液置于3mL比色皿中，用DMF定容，摇匀待测。取200 μL 20%的哌啶/DMF溶液置于3mL比色皿中，用DMF定容摇匀，作为空白对照。在紫外分光光度计301nm处测定吸光光度(A)，并根据下式计算树脂取代度。

式中，A为3次测取吸光度值的平均值；15为稀释倍数；e为Fmoc结构基团在301nm处的特征吸收值；m为称取树脂质量(单位为mg)；S为每克树脂中连接的氨基酸的毫摩数。取平均值测得Fmoc-aa-CTC树脂的取代度。

2 结果与讨论

2.1 Fmoc-aa-CTC红外光谱分析

(a)Fomc-Gly-CTC; (b)Fomc-Asp(OtBu)-CTC; (c) Fomc-His(Trt)-CTC; (d)Fomc-Phe-CTC; (e)Fomc-Tyr-CTC

图1为五种Fomc保护的氨基酸与2-CTC树脂反应后产物的红外光谱谱图，其中(a)-(e)分别代表Fomc-Gly-CTC、Fomc-Asp(OtBu)-CTC、Fomc-His(Trt)-CTC、Fomc-Phe-CTC和Fomc-Tyr-CTC。2-CTC树脂(图2)是在聚苯乙烯微球表面连接多个2-氯三苯甲基氯基团。其与Fomc保护氨基酸连接后，在树脂中引入了肽键，因此可通过检测各树脂红外光谱图中是否出现羰基以及亚氨基的特征峰来确定是否将Fomc保护氨基酸成功连接到2-CTC树脂上。

图2 2-CTC树脂

从图1(a)-(e)中可见，Fomc-aa-CTC树脂分别在1734.00、1732.07、1724.36、1724.36和1728.29 cm-1处出现了非常明显的羰基特征吸收峰，在3429.43、3431.36、3423.64、3427.50和3429.43 cm-1处出现了亚氨基的特征吸收峰。证明在2-CTC树脂上成功连接了Fomc保护的氨基酸。因氨基酸结构的差异，各峰出现的位置稍有不同

2.2 氨基酸结构对Fmoc-aa-CTC树脂取代度的影响

选择五种性质差异较为明显的Fomc保护氨基酸分别与2-CTC树脂进行缩合反应，保护氨基酸的种类、结构及最终树脂的取代度分别列于表1。从表中可知，Fomc-Gly-OH在五种保护氨基酸中体积最小，在与2-CTC树脂反应过程中，其空间位阻最小，因此Fmoc-Gly-CTC取代度最高，为0.824 mmol/g；Fomc-His(Trt)-OH和Fomc-Asp(OtBu)-OH除Fomc保护基外，分子中还存在着氨基保护剂和羧基保护基，分子体积较大，因此它们二者最终的取代度明显减小。而Fomc-Tyr-OH和Fomc-Phe-OH的差别主要在苯环上存在的羟基，羟基的诱导效应使Fomc-Tyr-OH与2-CTC反应时的亲核能力增强，因此最终产物的取代度高于Fomc-Phe-OH。从五种Fmoc-aa-CTC树脂取代度结果可见，位阻效应对于缩合反应的影响占首位；当氨基酸结构类似时，氨基酸分子中取代基的诱导效应占主导。

表1 保护氨基酸的结构及Fmoc-aa-CTC树脂的取代度

2.3 树脂溶胀时间对Fmoc-aa-CTC树脂取代度的影响

2-CTC树脂以交联的聚苯乙烯微球为载体，在其表面接枝2-氯三苯甲基氯形成能够与Fomc保护的氨基酸连接的位点。在缩合反应进行前，需对2-CTC树脂进行溶胀，树脂充分溶胀，连接的基团最大伸展从而使反应位点最大程度的裸露在外，提高连接效率。本论文以Fomc-Phe-OH与2-CTC树脂的连接反应为例，考察了树脂溶胀时间对最终产物取代度的影响，结果列于表2。从表2中可以看出，随着溶胀时间的延长，Fomc-Phe-CTC树脂的取代度先增大，后减小，溶胀1h后反应得到的树脂取代度最高，为0.798mmol/g。出现这种现象是因为，树脂溶胀0.5h时还未达到最大溶胀，反应位点裸露不充分，因此取代度最小，随着溶胀时间的延长，树脂达到最大溶胀，但溶胀时间过长，树脂表面连接的2-氯三苯甲基氯基团可能发生脱落，使反应活性位点减小，最终树脂取代度降低。因此，制备Fmoc-aa-CTC树脂时，最适溶胀时间为1h。

表2 不同溶胀时间下Fomc-Phe-CTC树脂的取代度

3 结论

本文选择五种结构不同的Fomc保护氨基酸分别与2-CTC树脂进行缩合反应，制备了不同的Fmoc-aa-CTC树脂，考察了氨基酸结构和树脂溶胀时间对树脂取代度的影响。红外光谱表明，五种Fomc保护氨基酸均成功连接到2-CTC树脂上。保护氨基酸的位阻效应对于缩合反应的影响占首位，但当其结构类似时，氨基酸分子中取代基的诱导占主导。缩合反应前树脂的溶胀时间显著影响着最终Fmoc-aa-CTC树脂的氨基酸取代度，1h为最佳溶胀时间。

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(本文文献格式：李容庆，张丽影 ，于 洋，等.多肽固相合成中2-CTC树脂首位氨基酸连接效率影响因素的研究[J].山东化工，2017，46(04)：11-13.)

Study on the Influencing Factors of the First Amino Acid Linkage Efficiency with 2-CTC Resin in the Solid Phase Synthesis of Peptide

LiRongqing,ZhangLiying*,YuYang,LanHaoming,QuNing

(College Of Life Science, Key Laboratory of Biological and Chemical Engineering,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Dalian 116600，China)

In order to explore the influencing factors of the first amino acid linkage effiiency of 2-Chlorotritylchloride resin in the peptide solid phase synthesis, five kinds of different Fomc protection amino acids were used to react with 2-CTC resin, and the substituting degree of five Fomc-aa-CTC were determined. The results showed that the steric effect of the protectied amino acids have greatest impact on the substituting degree. While when the protectied amino acids having similar structure, the inducing effect of substituents in the amino acid became more important.

2-Chlorotritylchloride Resin；Fomc-aa-CTC；substituting degree

2016-12-07

大连民族学院大学生创新训练项目(X2013040)

通讯作者：张丽影，zhangly@dlnu.edu.cn。

TQ464.7

A

1008-021X(2017)04-0011-03