动物源性食品中呋喃它酮代谢物酶联免疫检测方法的建立

刘静静

摘要：建立了呋喃它酮代谢物（AMOZ）在动物源性食品中残留的酶联免疫吸附检测法（ELISA）。本研究应用杂交瘤技术制备抗呋喃它酮代谢物的衍生物（CPAMOZ）单克隆抗体，测定单抗特性，并初步应用于AMOZ的ELISA方法检测。融合后得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株AMOZ-2F7，应用于酶联免疫吸附法，在0.0975—6.25μg/L范围内呈较好的线性，半数抑制浓度（IC₅₀）为1.011μg/L，与其他几种结构类似物无交叉反应。本研究建立了AMOZ检测的ELISA方法，可以实现样品的快速检测。

关键词：呋喃它酮代谢物；单克隆抗体；酶联免疫吸附法

1主要试剂及仪器

HAT，HT，鼠单抗分型试剂盒，Sigma公司；DMEM培养基，Gibco公司；SP2/0细胞，本实验室保存。其他试剂均为国产分析纯；二氧化碳培养箱，日本三洋；净化工作台，苏州净化设备有限公司；酶标仪，美国Bio-TEK；96孔、24孔培养板，Cost～公司。CPAMOZ-BSA、CPAMOZ-OVA本研究室自制。

2实验方法

2.1单克隆抗体的制备及特性鉴定

CPAMOZ-BSA免疫Balb/C小鼠共4次，ELISA方法检测血清，选择效价高、敏感性好的小鼠用于融合。经筛选、亚克隆，建立稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，并扩大培养，诱生腹水，经辛酸一硫酸铵沉淀法纯化，-20℃保存。对单克隆抗体的效价、敏感性、亚型进行测定。

2.2ELISA方法的优化

2.2.1抗原抗体最适浓度的确定

采用方阵滴定法，横向用梯度浓度的包被原包被，纵向加入倍比稀释的单克隆抗体，用间接ELISA法测定吸光度值。

2.2.2抗原抗体最适反应时间的选择

本研究选用10min、20min、30min、45min、60min作为一抗的作用时间，用间接竞争ELISA法测定IC₅₀值，选择最佳反应时间。

2.2.3标準曲线的制作

采用最佳ELISA工作条件，加入系列稀释的NPAMOZ，用间接竞争ELISA法测定吸光度值。

2.2.4特异性的测定

采用竞争ELISA分别检测抗AMOZ单克隆抗体与其他几种结构类似物的交叉反应，计算交叉反应率（Cross reaction，CR），CR=（NPAMOZ的IC₅₀/结构类似物的IC₅₀）×100。根据CR值判定单抗的特异性。

3结果与讨论

3.1单抗的制备及特性鉴定

融合后经筛选得到1株稳定分泌抗体且特异性较好的细胞株，命名为2F7。腹水纯化后经检测，效价达到1：1×106。用间接竞争ELISA检测，绘制标准抑制曲线，计算半数抑制质量浓度（IC₅₀）为1.084μg/L。单抗亚型经测定，与IgG1二抗反应的吸光度值最高，证明抗体为IgG1型。

3.2ELISA方法的优化

3.2.1抗原抗体工作浓度的确定

按抗原抗体1：40000、1μg/mL，1：20000、0.5μg/mL，1：10000、0.25μg/mL 3组浓度，用间接竞争ELISA检测。随着包被浓度的降低，抑制曲线在上移，IC₅₀值在上升，抗体1：40000和1：20000的曲线比较接近，且抗体1：20000时线性较好，综合考虑，选择抗原0.5μg/mL、抗体1：2万作为AMOZ的ELISA法最佳抗原抗体浓度。

3.2.2抗原抗体反应时间的选择

随着抗体和抗原作用时间的增加，抑制曲线呈下移趋势，且45-60min变化不大，综合考虑，选择线性较好的45min，作为AMOz间接竞争ELISA的一抗作用时间。

3.2.3标准曲线的制作

按照ELISA最佳工作条件，以NPAMOZ为横坐标，以B/B0（B代表不同浓度标准品的A_450mm，B0代表阴性对照的A_450mm）为纵坐标，绘制抗体的抑制曲线。如图1所示，AMOZ ELISA试剂盒在O.0975-6.25pg/L范围内呈线性，IC50=1.01log/L，线性方程Y=-0.399X+0.5019，R2=0.992。

3.2.4特异性的测定

采用间接竞争ELISA法检测，AMOZ-2F7抗体与NPAHD、NPAOZ、NPSEM、4-CBA的交叉反应率均小于0.01%，证明单抗与其他几种结构类似物不发生反应，该方法具有很高的特异性。

4结论

呋喃它酮属于小分子物质，没有免疫原性，所以在抗体制备过程中用对羧基苯甲醛将其衍生成CPAMOZ，再通过活化酯法将其衍生物与大分子载体蛋白进行连接，使其具备免疫原性。小分子抗原在杂交瘤细胞筛选过程中常出现效价高、敏感性差的结果。本实验用不同批次免疫原多次免疫、多次融合，以提高分泌强阳性、高抑制抗体的融合细胞数量。经过筛选，最终得到1株稳定分泌抗体的细胞，单抗AMOZ-2F7经检测，效价达到1：1×10⁶。将该抗体应用于ELISA方法检测，在0.0975-6.25μg/L范围呈现较好线性，ICso为1.011μg/L，与其他结构类似物无交叉反应。本研究得到的抗体特异性好、敏感性高，建立了ELISA检测方法，呈现较好性能，为免疫学检测技术研究和动物源性食品中兽药残留的快速检测奠定了基础。

（作者单位：河北省科学院生物研究所）