SPE—HPLC测定乐舒洗液中黄柏碱含量

杨妮 毛桂福 王宏虹 谢巍 林威

摘要：目的 建立乐舒洗液中黄柏的薄层鉴别，以及用固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）测定黄柏碱含量的方法。方法 采用薄层色谱法对乐舒洗液中的黄柏进行定性鉴别。采用Bond Elut plexa PCX强阳离子交换固相萃取小柱净化，Platisil-NH2柱为色谱柱，柱温为30 ℃，流动相为0.3%三乙胺（磷酸调pH 3.82）-四氢呋喃-乙腈（18∶12∶70），等度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为286 nm，测定乐舒洗液中黄柏碱的含量。结果 薄层色谱法能明显检出黄柏的特征有效成分黄柏碱；黄柏碱在1.22～12.2 ?g（r=0.999 9）范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率为101.18%，RSD=1.71%。结论 本方法操作简单，准确性、重复性好，可用于乐舒洗液的质量控制。

关键词：固相萃取；高效液相色谱法；乐舒洗液；黄柏碱

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）09-

Content Determination of Phellodendrine in Leshu Lotionby SPE-HPLC YANG Ni， MAO Gui-fu， WANG Hong-hong， XIE Wei， LIN Wei （Women and Childrens Health Care Hospital of Liuzhou City， Liuzhou 545001， China）

Abstract： Objective To establish the method of thin layer identification of Phellodendri Chinensis Cortex and solid phase extraction - high performance liquid chromatography （SPE-HPLC） determination of the content of phellodendrine in Leshu Lotion. Methods Thin layer chromatography （TLC） was used for qualitative identification of Phellodendri Chinensis Cortex in Leshu Lotion and the Bond Elutplexa PCX strong cation-exchange solid phase was used for extraction small column purification. Platisil-NH2 column was as chromatographic column； column temperature was 30 ℃； triethylamine pH 3.82 （phosphoric acid）， tetrahydrofuran， acetonitrile was 18：12：70， isocratic elution； flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 286 nm. Results TLC could obviously identify active ingredients of phellodendrine in Phellodendri Chinensis Cortex. The phellodendrine had good linear relationship between concentration and peak area within the scope of 1.22–12.2 ?g （r=0.999 9）； the average recovery rate of phellodendrine was 101.18%， RSD was 1.71%. Conclusion This method is simple to operate， with accuracy and repeatability， and can be used for quality control of Leshu Lotion.

Key words： solid phase extraction； HPLC； Leshu Lotion； phellodendrine

樂舒洗液是柳州市妇幼保健院的传统制剂，其生产工艺较为稳定，处方由百部、黄柏、苦参、白鲜皮、蛇床子等9味药组成，具有抗菌、消炎、止痒、收敛、杀灭阴道滴虫、除臭等作用。一般采用HPLC测定黄柏碱的含量[1]，但乐舒洗液中含明矾较多，色谱分析过程中明矾易析出而损害色谱柱。固相萃取是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，再利用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离待测化合物的目的，该方法简便，能在短时间内处理大量样品，且能

基金项目：柳州市应用技术研究与开发计划（2011J0302035）

通讯作者：毛桂福，E-mail：maogf2005@sina.com

有效去除样品中杂质的干扰，是目前公认的用于液体样品浓缩、富集最为有效的前处理技术之一[2]。为加强对乐舒洗液的质量控制，保证制剂疗效，本试验建立一种结果准确、回收稳定、样品处理简便、净化效果好的固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC），测定乐舒洗液中有效成分黄柏碱的含量。

1 仪器和试药

岛津LC-20AT四元梯度高效液相色谱系统（LC-20AT泵、Rheodyne 7725i型进样阀、SPD-20A紫外检测器、CTO-20A柱温箱、DGu-20A在线脱气机），日本岛津；PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司；KQ-300DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HANGPINGFA1004型电子天平，上海天平仪器厂。Bond Elut Plexe PCX混合型强阳离子交换小柱（500 mg/6 mL）、Bond Elut-AL-A氧化铝固相萃取小柱（500 mg/3 mL），Agilent公司；Agela Cleanert COOH弱酸型阳离子交换小柱（500 mg/6 mL）、Agela Cleanert ODS C18固相萃取小柱（1000 mg/6 mL），北京艾杰尔公司。

盐酸黄柏碱对照品（批号110721，含量≥98%），四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為HPLC纯试剂，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。乐舒洗液样品（本院制剂室，批号分别为2015121501、2015121502、2016042001、2016042002）。

2 方法与结果

2.1 黄柏的薄层鉴别

精密量取乐舒洗液20 mL，加甲醇20 mL，超声处理20 min，过滤，挥干溶剂，用2 mL甲醇溶解，离心，取上清液，即得供试品溶液。同法制成缺黄柏阴性对照溶液。精密称取黄柏对照药材0.1 g，置锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声处理20 min，过滤，浓缩至2 mL，即得对照药材溶液。精密称取黄柏碱对照品6.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得对照品溶液。按薄层色谱法（2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，取上述供试品溶液15 ?L，对照药材溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 ?L，分别点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品相应的位置上，均显相同的橙色斑点，阴性对照无干扰。

2.2 黄柏碱含量测定

2.2.1 溶液的制备

2.2.1.1 对照品贮备液 精密称取黄柏碱对照品6.10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得黄柏碱浓度为0.61 mg/mL的对照品贮备液。

2.2.1.2 供试品溶液 取乐舒洗液样品，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）30 min，摇匀，过滤，精密量取续滤液2.0 mL，加于PCX混合型强阳离子交换小柱（预先依次用甲醇5.0 mL、0.5 mol/mL盐酸溶液5 mL活化）上，流速为1.5 mL/min，依次用0.5 mol/mL盐酸溶液12 mL、甲醇12 mL、50%甲醇水溶液6 mL洗涤，弃去洗液，抽干静置1 min，再用20%浓氨甲醇溶液20 mL洗脱，收集洗脱液，置90 ℃水浴中吹干，残渣用流动相定容至2 mL，即得。

2.2.1.3 阴性对照溶液 按照乐舒洗液制备工艺制备缺黄柏阴性样品，再按供试品溶液制备方法操作，即得缺黄柏阴性对照溶液。

2.2.2 色谱条件与系统适用性 采用Platisil-NH2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 ?m），柱温30 ℃，流动相为0.3%三乙胺（磷酸调pH 3.82）-四氢呋喃-乙腈（18∶12∶70，V/V/V），流速1.0 mL/min，检测波长286 mn，进样量20 ?L。理论塔板数按黄柏碱峰计算应不低于12 000，黄柏碱保留时间为9.2 min。在此条件下，黄柏碱与其他相邻色谱峰均达到有效分离，分离度均大于1.5。

2.2.3 专属性试验 分别取阴性对照溶液、对照品溶液与供试品溶液各20 ?L进行检测，结果见图2。结果表明，阴性对照溶液在供试品溶液色谱图中黄柏碱吸收峰位置上无色谱峰出现，表明阴性对照溶液中其他杂质对测定无干扰。

2.2.4 标准曲线 精密吸取黄柏碱对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分别置10.0 mL容量瓶中，加甲醇定容，分别得到浓度为0.061、0.122、0.244、0.366、0.488、0.61 mg/mL的系列对照品溶液，分别进样20 ?L，记录峰面积，以对照品质量浓度（?g/mL，C）对峰面积（A）进行回归，得标准曲线方程A=32 964C+20 251，r=0.999 9。结果表明，黄柏碱在1.22～12.2 ?g范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一浓度黄柏碱对照品溶液，连续进样6次，测得黄柏碱峰面积RSD=0.94%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批号样品6份，按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定黄柏碱含量，结果RSD=1.63%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 将已知黄柏碱含量的样品超声处理30 min，滤纸过滤，精密吸取2 mL，共9份，分别上样于活化的PCX混合型强阳离子交换小柱，分别加入一定量的黄柏碱对照品溶液，按供试品溶液制备方法处理，测定黄柏碱的含量并计算回收率，结果见表1。

2.2.8 样品含量测定 取4批样品，每批平行2份，按上述方法制备供试品溶液，分别进样测定峰面积并计算黄柏碱含量，结果见表2。

3 讨论

在黄柏的薄层鉴别过程中，曾尝试以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）为展开剂[3]，置氨蒸气预饱和展开，置紫外光灯（365 nm）下检视，发现样品中黄柏碱分离效果差，拖尾严重，故采用药典方法进行薄层鉴别。

乐舒洗液中黄柏碱含量较高，过滤后可直接测定，但乐舒洗液含明矾较多，色谱分析过程中明矾容易析出，使柱效迅速降低，柱压快速升高。选用固相萃取法制备供试品溶液，可除去供试品中的无机盐及杂质，有利于延长色谱柱使用寿命。

由于黄柏碱结构中既含有碱性叔氨基，又含有2个酸性的酚羟基，是典型的两性化合物[4]，试验中比较了PCX混合型强阳离子交换小柱、氧化铝固相萃取小柱、弱酸型阳离子交换小柱、ODS C18固相萃取小柱，只有PCX混合型强阳离子交换柱对黄柏碱有较强的保留，能使碱性化合物从酸性和中性杂质中分离出来，虽然强碱（如季铵碱类小檗碱等）会不可逆地保留在强阳离子交换柱上，但对黄柏碱的萃取分离影响不大，每支强阳离子交换柱仍可重复使用10余次，故选择PCX混合型强阳离子交换小柱。

本试验对SPE洗脱条件进行了优化。首先，考察洗脱杂质的溶剂0.5 mol/mL盐酸体积（6、8、10、12 mL）和甲醇体积（6、8、10、12 mL），结果发现，用盐酸溶液6 mL和甲醇10 mL能有效除去无机盐及极性小的有机杂质。其次，比较了水及50%甲醇水溶液去除极性大的有机杂质的效果，发现50%甲醇水溶液除杂效果较好。最后，考察洗脱溶剂20%浓氨甲醇溶液体积（5、10、15、20、25 mL），发现20 mL洗脱溶剂才能完全洗脱黄柏碱，故选择洗脱溶剂体积为20 mL。

由于黄柏碱的两性化合物结构特点，极性较大，在常规的C18柱中不易保留，柱效低，而选用氨基柱，以乙腈-四氢呋喃-0.3%三乙胺溶液为流动相，黄柏碱可以得到较好保留，并获得极高的柱效，从而提高分离效果。流动相pH值对黄柏碱色谱峰的峰形、保留时间影响较大，当pH值调至3.82时，柱效较高，峰形最佳，与杂质峰分离效果好。分析样品的pH值对柱效、峰形、保留时间也有影响，如用甲醇作分析样品溶剂，柱效稍有降低，峰形稍微变宽；使用pH值4.7以上的流动相作样品溶剂，柱效会明显降低，峰形明显变宽。

参考文献：

[1] 王舒.黄柏的研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（8）：39，111.

[2] 陈蕾.固相萃取技术在中药分析中的应用[J].中国药事，2012，26（2）：159-161.

[3] 张芳，张波.黄柏八味胶囊中主要药味的薄层色谱鉴别[J].医药导报， 2016，35（z1）：95-96.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：305.

（收稿日期：2016-12-19）

（修回日期：2017-01-11；编辑：陈静）