酶辅助碱解猪毛提取角蛋白工艺优化

郭思亚，向鹏妍，吴 婷，孟 婧，张

（成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都610106）

酶辅助碱解猪毛提取角蛋白工艺优化

郭思亚，向鹏妍，吴 婷，孟 婧，*张

（成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都610106）

为了提高化学法水解猪毛提取角蛋白效率，探讨了采用酶辅助碱解法提取猪毛中角蛋白工艺，并对提取工艺进行了响应面法优化。通过比较盐酸和氢氧化钠对猪毛的水解效果，发现氢氧化钠更有利于角蛋白的提取。通过比较酶辅助氢氧化钠水解猪毛，发现酶辅助碱解猪毛显著（p＜0.05）提高了角蛋白的提取效率。采用响应面法对酶辅助碱解工艺进行优化，得出碱浓度和碱解时间的共同作用对角蛋白的提取有显著影响（p＜0.05）。拟合显著性及验证结果显示，所建立的拟合模型具有可靠性。根据拟合模型，对酶辅助碱解工艺进行优化，得出碱浓度0.4 mol/L，碱解时间3 h时，酶辅助碱解效果最好。

猪毛；酶解；工艺优化

我国是生猪生产大国，生猪屠宰产生的猪毛副产物较多。目前，国内的生猪屠宰企业对猪毛的回收利用较少，大多作为屠宰副产物被丢弃[1]。猪毛中角蛋白含量较高[2]。角蛋白是一种材料力学特性良好的生物可降解天然高分子，因其半胱氨酸含量高，含有二硫键，所以分子结构稳定，坚固性和弹性好[3]，可广泛应用于医学、农业、轻工业及日用化妆品等领域[4-7]。如果能将猪毛中的角蛋白回收利用，不仅可减少生猪屠宰企业的废弃物排放量，而且可充分利用生猪屠宰副产物，降低生猪生产成本[2]。为此，国内外研究人员对猪毛中角蛋白的提取工艺展开了广泛研究。

罗海波等人[8]采用尿素-焦亚硫酸钠降解制革废弃猪毛制备角蛋白，得出在pH值6.5，焦亚硫酸钠浓度1.0 mol/L，尿素浓度14 mol/L，十二烷基硫酸钠浓度0.2 mol/L，时间8 h时水解效果较好；Joua C J G等人[9]采用微波辅助酸解法水解猪毛，结果发现较传统的加热条件下酸水解工艺的水解效果更优；朱广军[10]研究了从猪毛中制取胱氨酸的新工艺，在控制pH值、活性炭用量条件下，猪毛中胱氨酸的得率达7.5%。但是，目前国内外采用酶辅助碱解法提取猪毛角蛋白的研究少有报道。为此，探讨了酶辅助碱解猪毛提取角蛋白工艺，以期为建立低污染的提取猪毛中角蛋白工艺提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

THZ-82型水浴恒温振荡器，常德澳华仪器有限公司产品；FE20-FiveEasyTM型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；HZ85-2型磁力搅拌器，北京中兴伟业仪器有限公司产品；XW-80A型涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂产品；UV-1800PC型紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司产品；PH2000型生物显微镜，凤凰光学控股有限公司产品。

试验所用猪毛，由四川欣康绿食品有限公司提供；牛血清蛋白（＞98%）、木瓜蛋白酶（≥50× 104U/g），北京奥博星生物技术有限责任公司提供；酒石酸钾钠、硫酸铜、碘化钾及盐酸（33%～36%），成都科龙化工试剂厂提供；氢氧化钠，成都金山化学试剂有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

参考李中和[11]的方法，按照水与30%氢氧化钠溶液10∶1的比例混合，控制pH值在8.5～9.0。然后加入一定量的猪毛，刚好使其淹没，不断搅拌2 h后，滤去污水，用自来水反复冲洗，至溶液呈现中性为止（pH值7）。将猪毛晾干，在121℃高温灭菌25 min，然后剪碎（长度大约1 cm），封口袋包装，于室温下贮藏。

1.2.2 酸碱水解猪毛效果比较

酸碱浓度均为0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 mol/L，分别配制各浓度盐酸及氢氧化钠溶液50 mL于100 mL锥形瓶中，将各个锥形瓶依次加入1.0 g猪毛，并用锡箔纸封口，同时置于水浴锅中，在温度80℃条件下，分别水解2，4，6，8 h。到达相应时间后，取出水解液，待温度降至室温后，分别用等摩尔量的酸或碱调节酶解液pH值至7，加蒸馏水定容至100 mL，吸取滤液。将所得的样品溶液各取0.5 mL到不同试管中，采用双缩脲法测蛋白质含量[12]。

1.2.3 碱解与酶辅助碱解对比试验

对单独碱解和酶辅助碱解的水解效果进行比较。分别配制不同浓度的碱溶液50 mL于100 mL锥形瓶中，置于水浴锅中，在80℃下水解2 h和4 h。水解结束待锥形瓶冷却后用等摩尔量的酸中和至pH值7，定容至100 mL。只用碱解的样液直接过滤测定吸光度；酶辅助碱解的样液加入0.1 g木瓜蛋白酶，在振荡水浴锅中，于55℃下水浴4 h，水浴完后过滤再测定吸光度，以木瓜蛋白酶的酸碱中和液为空白。

1.2.4 酶辅助碱解单因素试验

（1）碱浓度对酶辅助碱解试验结果的影响。猪毛用量1.0 g，在碱浓度0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 mol/L条件下，分别碱解2 h，调节酶解液pH值至7，添加0.1 g木瓜蛋白酶，于55℃下水浴4 h，水浴完后过滤再测定吸光度，以木瓜蛋白酶的酸碱中和液为空白。

（2）碱解时间对酶辅助碱解试验结果的影响。猪毛用量1.0 g，根据1.2.4（1）得出的最佳水解猪毛碱浓度，分别碱解1，2，3，4，5，6 h，然后调节水解液pH值至7，添加0.1 g木瓜蛋白酶，于55℃下水浴4 h，过滤再测定吸光度，以木瓜蛋白酶的酸碱中和液为空白。

1.2.5 酶辅助碱解优化试验

在单因素试验基础上，以水解液蛋白含量为响应值，选取碱溶液浓度和碱解时间为影响因子，采用一中心三水平旋转设计，对酶辅助碱解猪毛工艺进行优化。

优化试验因素与水平设计见表1。

表1 优化试验因素与水平设计

1.2.6 猪毛碱解后的表面特征分析

采用PH2000型生物显微镜，对碱解不同时间后猪毛的表面结构变化进行观察。

1.2.7 数据计算与处理

采用SAS 9.0对数据的显著性进行分析，采用Excel 2010对分析结果进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 酸和碱对猪毛水解提取角蛋白效果比较

由于猪毛难以被酶直接分解，所以首先采用酸或碱处理来破坏其天然结构，以便进一步酶解。为了选择一种更有效破坏猪毛天然结构的方法，根据文献报道[13]，采用盐酸和氢氧化钠水解猪毛，并对两者的水解效果进行比较。

酸解与碱解对比试验结果见图1。

图1 酸解与碱解对比试验结果

由图1可知，在相同碱浓度和水解时间条件下，碱解猪毛产生角蛋白的量均优于酸解。猪毛中胱氨酸及精氨酸含量丰富[14]。胱氨酸通过在猪毛蛋白的肽链间形成二硫键而起到链接平行肽链的作用，而精氨酸更多的是存在于肽链中。当酸解猪毛时，尽管盐酸容易破坏二硫键，但不能很快使猪毛中的肽链断裂。氢氧化钠虽然对二硫键的破坏较盐酸弱，但可以有效促进肽链中精氨酸与其他氨基酸的链接处发生水解，导致猪毛天然结构的破坏。这可能是出现图1中氢氧化钠较盐酸对猪毛有更好水解效果的原因。

2.2 碱解与酶辅助碱解对比

为了进一步比较酶辅助碱解猪毛提取角蛋白的水解效果，选择氢氧化钠浓度0.8 mol/L，在碱解猪毛基础上，添加酶对猪毛进行水解。

碱解与酶辅助碱解对比试验见图2。

图2 碱解与酶辅助碱解对比试验

由图2可知，水解2 h后，酶辅助碱解所得酶解液的蛋白质含量尽管较单独碱解高，但二者无显著差异（p＞0.05）；当水解4 h后，酶辅助碱解所得酶解液的蛋白质含量显著（p＜0.05），高于单独碱解。因此，采用酶辅助碱解，较单独的碱解能有效提高猪毛的水解效率。碱解可有效破坏猪毛蛋白中精氨酸与其他氨基酸形成的肽键，因而可以促进猪毛角蛋白的提取。但是，随着水解程度的增加，水解产生的多肽羧基端易与氢氧化钠发生中和反应，因而在一定程度上会抑制碱对猪毛的水解。在碱解后采用酶辅助水解，可以在一定程度上弥补单纯碱解的不足。短时间碱解对猪毛表面结构的破坏不够，导致酶解效果不佳。这些可能是导致图2中2 h后酶辅助碱解的蛋白质含量与单独碱解无显著差异，而4 h后酶辅助碱解能显著提高猪毛水解效果的原因。

2.3 酶辅助碱解单因素试验

由图2可知，酶辅助碱解4 h能显著提高猪毛蛋白的水解效果（p＜0.05）。因此，在保持酶用量不变条件下，对碱浓度和碱解时间进行优化，可在一定程度上提高水解效率。为此，对猪毛的酶辅助碱解工艺进行了优化。

2.3.1 碱浓度对猪毛水解效果的影响

固定酶用量，保持碱解时间2 h，分别对碱浓度为0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 mol/L时的水解效果进行比较。

碱浓度对猪毛水解液中蛋白含量的影响见图3。

图3 碱浓度对猪毛水解液中蛋白含量的影响

由图3可知，随着碱浓度增加，酶解液中蛋白质含量呈现先增加后降低趋势。当碱浓度为0.4 mol/L时，所得酶解液的蛋白质含量显著高于其他浓度（p＜0.05）；碱浓度为0.2 mol/L和0.8 mol/L时，所得酶解液的蛋白质含量无显著差异（p＞0.05）；类似结果出现在碱浓度为1.6 mol/L和2.0 mol/L时所得酶解液的蛋白质含量。因此，在优化试验中，应以0.3 mol/L和0.5 mol/L作为碱浓度的上限值和下限值。在碱解时间固定时，碱浓度越高，越有利于猪毛中肽链的断裂，但是过高的碱浓度，容易促进水解后的肽链的疏水端聚合，因而会在一定程度上阻碍猪毛蛋白的肽链进一步水解。这可能导致图3中，随着碱浓度增加，水解液中蛋白质含量先呈现显著降低、随后变化不显著的原因。

2.3.2 碱解时间对猪毛水解效果的影响

碱解时间对猪毛水解液中蛋白含量的影响见图4。

图4 碱解时间对猪毛水解液中蛋白含量的影响

由图4可知，随着碱解时间增加，水解液的蛋白质含量呈现先显著增加（p＜0.05），而后显著降低的趋势（p＜0.05）。碱解3 h时，水解液中的蛋白质含量显著高于其他水解时间（p＜0.05）。因此，在优化试验中，应以1.5 h和3.0 h作为碱解时间的上限值和下限值。在碱浓度不变条件下，随着碱解时间增加，碱的消耗量增加，有效碱浓度降低，因而会减少碱对猪毛蛋白中肽链的分解作用。前期的碱解为后期的酶解提供物质基础，适当的碱解时间，可以对猪毛表面结构起到良好的破坏效果，为后期酶解提供良好条件。这可能就是导致图4中出现随着碱解时间增加，水解液中蛋白质含量先出现显著增加而后显著降低的原因。

2.4 酶辅助碱解工艺优化

2.4.1 优化方案及试验结果

根据酶辅助碱解的单因素试验结果，选择碱浓度0.3 mol/L和0.5 mol/L，碱解时间1.5 h和3.0 h作为优化限制，以水解液中蛋白含量作为响应值，对酶辅助碱解工艺进行优化，

猪血肠制作工艺优化试验方案及试验结果见表2。

表2 猪血肠制作工艺优化试验方案及试验结果

2.4.2 拟合显著性分析

对表2中所得试验结果进行显著性分析。

拟合显著性分析见表3。

表3 拟合显著性分析

表3中pX1=0.446 8＞0.05，pX3=0.260 5＞0.05的结果显示，碱浓度和碱解时间对水解效果无显著影响；但是pX1X1=0.045 9＜0.05，pX2X2=0.003 9＜0.01，p二次项= 0.007 4＜0.01的结果显示，碱浓度和碱解时间的组合对水解效果影响显著。因此，碱解浓度和碱解时间的共同作用对猪毛的碱解效果产生显著影响。

表3中p主模型=0.032 9＜0.05，p失拟项=0.555 5＞0.05，并且结合拟合相关性系数的平方为0.771 7可知，通过对碱浓度和碱解时间与水解效果的拟合，所得拟合模型式（1）具有一定可靠性。

2.4.3 拟合模型可靠性验证

为了进一步确保拟合模型式（1）的可靠性，以确保所得优化结果可靠，对式（1）计算的蛋白含量与实际测定的蛋白含量进行比较。

表2中测定和计算的水解液中蛋白含量的相对误差结果显示，均小于8%。由此可知，所得拟合模型具有一定可靠性，可用于酶辅助碱解最优工艺的预测。

2.4.4 优化结果

根据拟合模型，对最优酶辅助碱解工艺进行预测，得出氢氧化钠溶液浓度为0.4 mol/L，碱解时间为3 h时，所得水解液的蛋白浓度最高，对应的水解液中蛋白含量为103.274 mg/g。通过重复试验，对最优工艺进行实测验证，得出样液中蛋白含量为110.780±3.02 mg/g，与预测值103.274 mg/g相比，相对误差为6.77%。因此，预测结果与实际测定结果较吻合，氢氧化钠浓度0.4 mol/L，碱解时间3 h为酶辅助碱解猪毛制备角蛋白的最优工艺。

碱浓度和碱解时间对猪毛水解效果影响见图5。

图5 碱浓度和碱解时间对猪毛水解效果影响

2.5 碱解对猪毛微观结构影响

选取碱解5，15，25 min后的猪毛，观察其微观结构变化。

不同碱解时间下猪毛的结构变化见图6。

由图6可知，未碱解的猪毛表面光滑、结构完整；碱解5 min后，猪毛局部出现表面结构破坏；碱解15 min和25 min后，猪毛整体出现丝状。由此可见，碱解可有效破坏猪毛的天然结构。这也进一步验证了前面所提及碱解破坏猪毛的表面结构，为后期酶解提供物质基础的猜测。

图6 不同碱解时间下猪毛的结构变化

3 结论

通过比较盐酸和氢氧化钠对猪毛的水解效果，发现氢氧化钠更有利于猪毛的水解。比较酶辅助氢氧化钠水解猪毛，发现酶辅助碱解猪毛能显著提高猪毛的水解效果（p＜0.05）。对酶辅助碱解工艺进行优化，得出碱浓度0.4 mol/L，碱解时间3 h时，所得碱解液中的蛋白含量最高。

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Process Optimization of Enzyme Assisted Alkaline Hydrolysis to Extract Keratin from Pig Hair

GUO Siya，XIANG Pengyan，WU Ting，MENG Jing，*ZHANG Yin
（Sichuan Provincial Key Laboratory of Meat Processing，Chengdu University，Chengdu，Sichuan 610106，China）

To improve the efficiency of alkaline hydrolysis to extract keratin from pig hair，effect of enzyme assisted alkaline hydrolysis on extraction ratio of keratin is investigated，and the extraction process is optimized with response surface method. By comparing effect of acid and alkaline hydrolysis on extraction ratio of keratin，it is found that sodium hydroxide is more efficiency for hydrolysis of pig hair.By comparing enzyme assisted sodium hydroxide to hydrolyze pig hair，it is found that enzyme assisted alkali solution significantly（p＜0.05）improved the hydrolysis efficiency.The results of response surface optimization indicate that the combined effect of alkali concentration and alkaline hydrolysis time had a significant effect（p＜0.05）on the hydrolysis of pig hair.The ANOVA of fitting results show that the obtained fitting model is reliable to be used to predict the optimal process of enzyme assisted alkaline hydrolysis of pig hair.According to the fitting model，the enzyme assisted alkali hydrolysis process is optimized，the results show that the extraction ratio of keratin is the highest when the alkali concentration is 0.4 mol/L and the alkaline hydrolysis time is 3 h.

pig hair；enzyme hydrolysis；process optimization

TS251.92

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.08.006

1671-9646（2017）08a-0019-05

2017-06-08

四川省应用基础项目（2017JY0086）；四川省教育厅重点项目（17ZA0084）。

郭思亚（1994—），女，硕士，研究方向为畜产品加工与保藏。

*通讯作者：张崟（1981—），男，博士，副教授，研究方向为畜产品加工与保藏。