右美托咪定对脓毒症患者外周血线粒体能量代谢相关基因表达的影响

邓兴，林名瑞，肖雄箭，林建东

（1.龙岩市第二医院ICU，福建龙岩364000；2.福建中医药大学附属人民医院ICU，福建福州350004；3.福建医科大学附属第一医院ICU，福建福州350005）

--论著--

右美托咪定对脓毒症患者外周血线粒体能量代谢相关基因表达的影响

邓兴1，林名瑞2，肖雄箭3，林建东3

（1.龙岩市第二医院ICU，福建龙岩364000；2.福建中医药大学附属人民医院ICU，福建福州350004；3.福建医科大学附属第一医院ICU，福建福州350005）

目的基于PCR Assay芯片技术，分析右美托咪定对脓毒症外周血线粒体能量代谢相关基因表达的变化并推论其可能的作用机制。方法选取50例老年严重脓毒症病例，随机分为右美托咪定治疗组与生理盐水对照组（常规治疗组）。右美托咪定干预前与干预后1、3天所有患者静脉采血立即提取RNA做PCR Assay基因芯片检测。结果右美托咪定组与常规治疗组相比，死亡率差异无统计学意义。经右美托咪定干预后，线粒体产能相关基因（如：Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i）从抑制转为活跃表达，以弥补机体高代谢状态下产能的减少。结论右美托咪定早期应用可调节机线粒体能量相关基因表达，使机体整体供能与应激期时能量代谢相匹配，从而起到对脓毒症的保护作用，但并不减少脓毒症患者死亡率。

脓毒症；右美托咪定；线粒体；能量代谢；PCR Assay

脓毒症3.0对脓毒症作出了新的释义，即脓毒症系感染基础上出现一定程度的器官功能障碍[1]。脓毒症作为危重病领域的常见病，引起危重病医学界的极大重视。尽管近年危重病专家对脓毒症的认识及治疗方式的改进，脓毒症患者死亡率有所下降，但随着人口老龄化发展，脓毒症的发病率却呈上升趋势，继而使脓毒症死亡人数呈逐年上升趋势[2]。继往研究显示：脓毒症早期，机体氧耗往往增加，但由于毛细血管渗漏致机体容量相对不足，导致机体组织器官有效灌注不足，进而引起组织缺氧，这更进一步加剧机体缺氧。线粒体因缺氧不能有效地驱动ADP氧化磷酸化为ATP，从而引起机体产能的减少，同时也可触发细胞死亡[3]。右美托咪定（DEX）属于高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂中的一种，在临床镇静、抗焦虑方面有一定的历史[4]。继往动物实验研究显示右美托咪定可使线粒体功能障碍大鼠受益[5]。但对于脓毒症早期使用右美托咪定镇静是否可改善外周血中线粒功能障碍国内外仍少见，本研究拟从基因水平对右美托咪定对脓毒症患者外周血线粒体能量代谢作用相关机制作一探讨。

1 资料与方法

1.1 实验方法选取2015年1月～2015年12月龙岩市第二医院重症医学科收治的50例老年严重脓毒症患者，随机分为右美托咪定治疗组（A组）与生理盐水对照组（常规治疗组，B组），各25例。严重脓毒症患者的准入标准参照中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南（2014）[6]。排除标准为合并外伤、免疫缺陷性疾患、乙肝表面抗原阳性、严重心血管疾病、终末期肝肾疾病、恶性肿瘤、长期使用镇静催眠药物及近3个月内使用激素或免疫抑制剂史。本研究符合医学伦理学标准，经医学伦理委员会批准，并获得患者家属的知情同意。随机选取10例健康体检老年人作为健康对照组（C组）。1.2临床资料本实验研究最终共纳入50例老年严重脓毒症患者，A组与B组在年龄、性别、APACHEⅡ评分等比较差异均无统计学意义。见表1。

表1 临床资料（x±s）Table 1 General clitical data(x±s)

1.3 治疗方法所有患者均在入ICU并给予常规重症监护、抗生素治疗、复苏、维持内环境稳定等一般治疗。A组则先予右美托咪定负荷量2.5μg/(kg·h)的速度静脉泵入，后改用0.2～0.7μg/(kg·h)的速度持续静脉泵入镇静，B组患者除了未予右美托咪定外其他治疗均相同，同时予同B组同等量的生理盐水进行对照。用药前与用药后1、3天所有患者静脉采血5 mL，取其中3 mL血液立即分离线粒体后提取RNA，-80℃保存，待做基因芯片检测。

1.4 观察指标及方法能量代谢相关基因表达量检测。按组及取材时间为单位，随机取10标本的RNA，进行混匀后，进一步提取mRNA，取2μg mRNA使用superscriptⅡ和Random Primer Hexamers（Invitrogen）反转录合成并纯化cDNA。然后在PCR Array的96孔板中各加入20 ng cDNA，依RT²Profiler™PCR Array使用说明设置循环数并进行PCR并计算出每个孔板中的Ct数。采用ΔΔCt方法计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt。ΔCt(group 1)= average Ct-average of HK genes’Ct for group 1 array ΔCt(group 2)=average Ct-average of HK genes’Ct for group 2 array。计算2个PCR Array（或两组）中每个基因的ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt(A组)-ΔCt (B组)。同过2-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料采用“x±s”表示，组间及组内比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床治疗及转归统计结果显示A组患者平均住院时间(15.72±5.04)与B组（15.76±3.95）接近（P=0.401）；两组患者28 d死亡率（0.24 vs 0.32）（P=0.529）。患者最终死亡原因多数为MODS。

2.2 相对于C组，A、B组Fold值改变情况右美托咪定干预后Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i的Fold绝对值趋向于升高趋势，而B组治疗前后，绝大多数Fold值变化并不大。见表2。

表2 相对于C组，右美托咪定干预前后及B组治疗前后相关有意义基因的表达情况Table 2 Compared to C group，the expression of related significant genes of before and after dexmedetomidine intervention and before and after treatment of B group

3 讨论

脓毒症是危重病，仍是重症医学科主要病种之一，具有极高的死亡率[2]。尽管随着其病理生理研究的深入及相关生命支持的进步，但其病死亡率仍不容忽视。研究显示，脓毒症引起的全身炎症反应综合征往往会导致细胞内热休克蛋白，组蛋白，DNA，线粒体等功能相应受损[7]。近年来研究指出，关于脓毒症与机体代谢盯着研究指出，系统性炎症反应可以以不同的方式影响线粒体：①在感染性休克灌注受损的早期，由于内在和外在的液体损失和摄入减少，血管张力减少，心肌收缩受抑制，微循环血流量重新分配能力丧失，这可致组织缺氧，即在线粒体内氧不足以驱动ADP的氧化磷酸化的ATP。虽然特殊的酶特性的复合物IV可以在氧气浓度较低时发挥有效功能，但非常低的水平可能会影响ATP的生成从而成为触发细胞死亡潜在的通路[8]。②NO，硫化氢，和其他活性氧过量产生直接抑制线粒体呼吸和直接损害线粒体蛋白和其他结构如脂质膜。一氧化氮和过氧亚硝基阴离子也被证明具有变化对其他呼吸链酶的影响[9]。③脓毒症中激素的改变对线粒体功能和效率的影响。例如，甲状腺激素被认为主要是发挥它的作用，通过调节线粒体功能，即在脓毒症早期，机体甲状腺功能就有可能受影响，即重症感染可引起“SES”或“低T3综合征”[10]。这在临床工作中也得到认可。

研究显示，脓毒症时，机体代谢加快，然而，因炎症反应相关的一系列级联反应严重影响机体线粒体的功能，进而引起机体能量生成障碍。这种供需矛盾，更进一步加重机体组织器官功能的障碍。右美托咪定作为一种α2-肾上腺素受体激动剂，主要涉及抑制去甲肾上腺素的释放和神经元的兴奋，可一定程度上抑制SIRS进一步发展[11-12]。例如：M Peng等人研究发现右美托咪定是一种有效的抑制脂多糖诱导的小胶质细胞活化的炎症[13]。另有研究发现，在心脏搭桥手术中，应用右美托咪定可减少机体产生IL-1，IL-6，TNF-α[14]。

本研究发现，脓毒症时，线粒体产能相关基因（如：Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i）表达受到一定程度的抑制，这从一定程度上抑制了线粒体呼吸，从而致使机体产能减少。经右美托咪定干预后，此基因表达水平升高明显，以弥补机体高代谢状态下产能的不足，而常规治疗，这些基因表达上调辐度相对较低，甚至仍以抑制为主。因此，右美托咪定可能通过调节线粒体产能相关基因的表达，从而起到维持机体代谢水平，

综上所述，脓毒症时机体线粒体产能相关基因表达明显受抑，右美托咪定可能通过调节线粒体产能相关基因的表达，从而起到对脓毒症患者保护作用,但并不减少脓毒症患者死亡率。

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Effect of dexmedetomidine on expression of mitochondrial energy metabolism related genes of peripheral blood in septic patients

Deng Xing1,Lin Ming-rui2,Xiao Xiong-jian3,Lin Jian-dong3
(1.Intensive Care Unit,The Second Hospital of Longyan,Longyan,Fujian,364000,China;2.Intensive Care Unit,TheAffiliated People’s Hospital of Fujian Traditional Medical University,Fuzhou,Fujian,350004,China;3.Intensive Care Unit,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,Fujian,350005,China)

Objective To analyze the changes of mitochondrial energy metabolism related genes of peripheral blood in septic patients were under Dexmedetomidine treatment based PCR Assay chip technology and to find its possible mechanism.Methods 50 cases of severe septic patients were selected.The patients were randomly divided into the Dexmedetomidine treatment group and normal saline control group(conventional treatment group).Before Dexmedetomidine given and 1,3 days post-intervention,venous blood of all patients was collected immediately and extract RNA,and then to do PCR Assay cDNA microarray.Results There was no significant difference in mortality between the dexmedetomidine group and the conventional treatment group.The expression of mitochondrial production-related genes(Ndufa1,Ndufab1,Ndufb2,Ndufs8,Sdha,Uqcrb, Cox8a,Atp5a1,Atp5i)are actived from inhibition to make up for the body's high metabolic capacity reduction.Conclusion Early application of Dexmedetomidine can regulate the expression of genes related to mitochondrial energy-related genes to match the body of the overall energy supply with energy metabolism during the stress period,which can protect the sepsis,but does not reduce the mortality of patients with sepsis.

Sepsis;Dexmedetomidine;Mitochondrion;Energy metabolism;PCRAssay

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.24.001

中华医学会临床医学科研专项资金-国瑞重症科研项目（13091440529）

林建东，E-mail：linjd@tom.com