多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响

李 颖，尹良伟，刘基巍，刘 鹏

(1. 大连医科大学附属第一医院 肿瘤一科, 辽宁 大连 116011；2. 大连医科大学附属大连市中心医院 肿瘤内科三病房, 辽宁 大连 116021)

论 著

多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响

李 颖1，尹良伟2，刘基巍1，刘 鹏2

(1. 大连医科大学附属第一医院 肿瘤一科, 辽宁 大连 116011；2. 大连医科大学附属大连市中心医院 肿瘤内科三病房, 辽宁 大连 116021)

目的 研究多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1(Cav-1)表达及细胞增殖的影响。方法 通过Real-time PCR和Western-blot检测不同浓度多西他赛作用下乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1的表达情况；野生型MCF-7细胞株为对照组,通过基因转染技术建立Cav-1 过表达的MCF-7细胞株(转染组)及空载体的MCF-7细胞株(空载体组)，利用CCK-8比色法分析多西他赛对各组细胞增殖的影响。通过Western-blot分别检测多西他赛作用下各组细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况以及PI3K/AKT 信号转导通路的活化情况。结果 在5～40 μg/mL浓度范围内，随着多西他赛作用浓度的增大，MCF-7细胞中Cav-1的蛋白表达量逐渐增加。不同浓度多西他赛对MCF-7细胞的增殖均有明显的抑制作用；在同一浓度多西他赛作用下，转染Cav-1组细胞的增殖抑制率明显高于对照组和空载体组(P<0.01)。与对照组和空载体组相比，20 μg/mL多西他赛作用后转染组细胞中Bax的表达升高(P<0.01)，而Bcl-2的表达降低(P<0.01)，并且磷酸化AKT (p-AKT)蛋白的表达水平下降(P<0.01)，而对照组和空载体组之间Bax、Bcl-2以及p-AKT蛋白的表达则无明显差异(P>0.05)。结论 多西他赛可以通过促进Cav-1的表达影响PI3K/AKT 信号转导通路，进而调节凋亡相关蛋白的表达抑制MCF-7 细胞的增殖。

Cav-1；多西他赛；乳腺癌细胞；细胞增殖；基因治疗

多西他赛(Docetaxel)作为新一代人工半合成的紫杉类抗肿瘤药物，目前已广泛用于一线和二线局部晚期以及复发、转移乳腺癌的治疗，明显改善了乳腺癌的治疗效果[1]。研究显示，多西他赛作为有丝分裂抑制剂，还可以通过激活凋亡相关蛋白和通路，诱导细胞凋亡，进而起到抑制肿瘤的作用，但具体机制尚不清楚。

窝蛋白-1(Cav-1)是胞膜窖(Caveolae)的主要结构成分和标志性结构蛋白，不但在细胞膜组装、细胞内脂质稳态和囊泡运输等方面起着重要的生理作用，而且与肿瘤细胞的增殖转化、侵袭转移、信号转导以及多药耐药等密切有关[2-3]。近年来研究表明，Cav-1可作为抑癌因子负性调控乳腺癌细胞增殖、转移等相关信号通路的激活，是进行乳腺癌基因治疗理想的靶点之一。

本实验通过研究多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响，并对其机制进行初步探讨，旨在了解基因治疗与化疗联合应用的特性以及临床应用的可能性，进而为乳腺癌个体化治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

人乳腺癌细胞株MCF-7购自南京凯基生物科技发展有限公司。RPMI 1640培养基、胰酶和胎牛血清购自Gibco公司，G418购自美国Sigma公司。多西他赛为江苏恒瑞制药公司惠赠。Lipofectamin 2000和TRIzol试剂为Invitrogen 公司产品，PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq II购自大连TaKaRa生物有限公司。兔抗人Cav-1、p-AKT 和 AKT 多克隆抗体购自美国 Abcam 公司，兔抗人Bcl-2和Bax多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人GAPDH多克隆抗体购自Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG购自北京中杉金桥生物公司，RIPA 强蛋白裂解液购自碧云天生物技术有限公司，ECL发光试剂盒购自美国 Pierce公司。CCK-8法细胞增殖检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。真核表达质粒pcDNA3.1-Cav-1及空载体pcDNA3.1由辽宁师范大学邹伟教授惠赠。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养与转染

MCF-7细胞常规培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。取2×105个对数生长期的MCF-7细胞悬于2 mL完全培养液中，接种于6 孔板内，待细胞长至90%汇合时按照Lipofectamine 2000 说明书进行细胞转染。将质粒pcDNA3.1-Cav-1及其空载体pcDNA3.1转染入MCF-7细胞后，经800 μg/mL G418筛选4周，形成稳定的细胞克隆，经有限稀释法获取单克隆，然后进行扩增培养，利用Western-blot 检测不同组细胞Cav-1的表达情况，得到稳定过表达Cav-1以及空载体的MCF-7细胞株。野生型MCF-7细胞株为对照组,通过基因转染技术建立Cav-1过表达的MCF-7细胞株(转染组)及空载体的MCF-7细胞株(空载体组)。

1.2.2 Real-time PCR

利用TRIzol试剂和PrimeScript RT reagent试剂盒提取细胞总RNA，并将其反转录成cDNA，在SYBR Premix Ex Taq II聚合酶的催化下进行PCR反应。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Cav-1上游引物：5'-TGGTTTTACCGCTTGCTGTCT-3'，下游引物：5'-GACACGGCTGATGCACTGAA-3'；内参照GAPDH上游引物：5'- AGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATC - 3'，下游引物：5'- CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3'。反应条件为： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，共40 个循环。每组细胞设计3个重复孔，同时扩增目的及内参照基因。采用 2-ΔΔct法计算基因表达的相对变化。

1.2.3 CCK-8分析

将对数生长期的细胞按1×105/mL的密度接种于96孔板中，培养24 h后加入多西他赛至终浓度分别为5、10、20、40 μg/mL，每一浓度设5个复孔，另设阴性对照组和空白对照组，继续培养24 h后更换100 μL新鲜培养基并加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育2 h后，全自动酶标仪在450 nm波长处测定各孔光密度值(OD值)，最后计算不同浓度多西他赛作用下各组细胞的增殖抑制率，绘制生长抑制曲线。细胞抑制率(%)=[1-(处理组平均OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组平均OD值-空白对照组OD值)]×100%。

1.2.4 Western-blot

用RIPA 强细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经浓度标准化后取 50 μg总蛋白，经12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿转法转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，孵育一抗Cav-1(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)、AKT(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶ 500)、GAPDH(1∶1000)，4 ℃过夜。 TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)室温孵育 1 h。使用ECL化学发光试剂作用1～5 min后，放入AlphaEase FC凝胶成像系统内，曝光显影，进行图片扫描与条带灰度分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 不同浓度多西他赛对乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1表达的影响

浓度为5、10、20、40 μg/mL多西他赛作用后的MCF-7细胞中Cav-1 mRNA的表达量分别是不加药对照组的2.90±0.26，4.80±0.40，9.83±0.45和13.50±1.25倍。0、5、10、20、40 μg/mL多西他赛作用后的MCF-7细胞中Cav-1蛋白条带的灰度值分别为：18.52×103±2.38×103，42.46×103±4.31×103，60.69×103±8.45×103，88.24×103±6.76×103，120.16×103± 9.25×103。在5～40 μg/mL浓度范围内，随着多西他赛作用浓度的增大，MCF-7细胞中Cav-1蛋白的表达量逐渐增加。见图1。

**与不加药对照组比较，P<0.01图1 多西他赛对MCF-7细胞中Cav-1表达的影响Fig 1 Effect of Docetaxel on Cav-1 expression in MCF-7 cells

2.2 多西他赛对不同组MCF-7细胞增殖的影响

CCK-8法检测发现，多西他赛对不同组MCF-7细胞的增殖均有明显的抑制作用，转染组作用最明显(图2)。在同一药物浓度下，转染组与对照组和空载体组相比，细胞增殖抑制率明显增高(图2,表1，P<0.01)，而空载体组和对照组相比，抑制率则无统计学差异(图2,表1，P>0.05)。

表1 CCK-8法检测不同浓度多西他赛对不同组MCF-7细胞的抑制率

组别多西他赛(μg/mL) 5 10 20 40对照组6.37±0.5712.22±1.0027.17±1.6744.65±1.90转染组12.32±1.591)22.25±1.911)46.76±1.911)65.04±2.551)空载体组6.89±0.8313.22±1.4429.2±1.7246.69±1.80

1)与对照组和空载体组比较，P<0.01

Control: 对照组; pcDNA3.1-cav-1:转染组;Vector:空载体组。**与对照组和空载体组比较，P<0.01图2 多西他赛对不同组MCF-7细胞增殖的影响Fig 2 Effect of Docetaxel on MCF-7 cells proliferation in different groups

2.3 多西他赛对不同组MCF-7细胞中Bax和Bcl-2表达的影响

用20 μg/mL多西他赛作用MCF-7细胞24 h后，利用Western-blot法检测不同组MCF-7细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。Bax蛋白条带的灰度值分别为：不加药对照组10.15×103±1.23×103，对照组+Docetaxel 42.53×103±4.61×103，转染组+Docetaxel 82.58×103±6.76×103，空载体组+Docetaxel 48.76×103±8.60×103；Bcl-2蛋白条带的灰度值分别为：不加药对照组47.64×103±5.25×103，对照组+Docetaxel 21.76×103±3.22×103，转染组+Docetaxel 6.52×103±0.41×103，空载体组+Docetaxel 18.93×103±5.38×103。与不加药对照组相比，多西他赛作用后各组MCF-7细胞中Bax蛋白的表达增加，而Bcl-2蛋白的表达降低。多西他赛作用后转染Cav-1的MCF-7细胞中Bax的表达水平明显高于对照组和空载体组(P<0.01)，而Bcl-2蛋白的表达水平则明显低于对照组和空载体组(P<0.01)。对照组和空载体组之间Bax和Bcl-2蛋白的表达则无明显差异(P>0.05)。见图3。

C: 对照组;C+D:对照组+Docetaxel; Cav-1+D:转染组+Docetaxel; V+D:空载体组+Docetaxel图3 多西他赛对不同组MCF-7细胞中Bax和Bcl-2表达的影响Fig 3 Effect of Docetaxel on Bax and Bcl-2 expression in three groups

2.4 多西他赛对不同组MCF-7细胞中p-AKT表达的影响

利用Western-blot法检测20 μg/mL多西他赛作用24 h后，不同组MCF-7细胞中PI3K/AKT 信号通路的活化情况。p-AKT蛋白条带的灰度值分别为：对照组72.13×103±6.82×103，对照组+Docetaxel 32.15×103±3.63×103，转染组+Docetaxel 8.32×103±1.76×103，空载体组+Docetaxel 36.42×103±7.16×103。与不加药对照组相比，多西他赛作用后各组MCF-7细胞中p-AKT表达降低。多西他赛作用后转染Cav-1的MCF-7细胞中p-AKT的表达水平明显低于对照组和空载体组(P<0.01)，对照组和空载体组p-AKT蛋白的表达则无统计学差异(P>0.05)。而各组细胞间总AKT蛋白的表达无统计学差异(P>0.05)。见图4。

C: 对照组;C+D:对照组+Docetaxel;Cav-1+D:转染组+Docetaxel; V+D:空载体组+Docetaxel图4 多西他赛对不同组MCF-7细胞中磷酸化AKT表达的影响Fig 4 Effect of Docetaxel on p-AKT expression in three groups

3 讨 论

化疗在乳腺癌的综合治疗中占有重要的地位，然而化学药物对机体的毒副作用往往限制了其剂量的使用，无法到达预期效果[4-5]。传统策略是将化疗药物和其他非抗癌药物联用，以缓解药物毒副作用，但这种做法并不能从根本上解决化疗毒副作用对疗效的影响。近年来肿瘤的生物治疗越来越受到重视，基因治疗作为肿瘤生物治疗的重要手段之一，不仅可以协同化疗实现化疗增敏以及防止化疗药物产生耐药性，还可以调控一系列肿瘤发生相关的信号通路达到靶向治疗效果，已日渐成为肿瘤治疗的一个重要途径[6-7]。

多西他赛属于紫杉醇类药物，可以通过促进微管蛋白异常聚合并保持其稳定，从而抑制细胞有丝分裂时纺锤体形成以及微管的其他功能；并能抑制微管蛋白解聚，破坏细胞的有丝分裂，使细胞阻滞在分裂期[8]。目前在临床已广泛应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌等多种恶性实体肿瘤治疗，取得显著疗效[9-11]。近年来研究发现，多西他赛可以诱导多种肿瘤细胞凋亡[12]，其主要机制可能与下调抑制凋亡蛋白Bcl -2的表达，上调促凋亡蛋白Bax 的表达有关，但多西他赛是否还可以通过作用于其他基因诱导肿瘤细胞的凋亡及其机制如何，目前尚不清楚。本研究发现，多西他赛可以促进乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1基因和蛋白的表达，并呈剂量依赖性，提示Cav-1可能在多西他赛诱导乳腺癌细胞凋亡中起重要作用。

Cav-1是细胞膜主要支架蛋白之一，其表达异常与乳腺癌的发生发展密切相关。研究发现，Cav-1在正常乳腺导管上皮细胞中具有较高的表达，而在乳腺癌组织及细胞中不表达或低表达。Cav-1表达下调会促进乳腺癌细胞增殖，而Cav-1 过表达则可显著抑制乳腺癌细胞的生长[13-14]。进一步研究表明，Cav-1 可直接与PI3K 结合或通过膜雌激素受体与PI3K 的p85 亚基相互作用，从而抑制PI3K/AK信号转导通路的活化，通过增加Bax的表达, 降低Bcl-2 的表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖[15]。本研究结果发现，多西他赛可明显抑制MCF-7细胞的增殖，同时能增加Bax并降低Bcl-2的表达量，与文献报道相一致[12]。其机制可能与降低AKT的磷酸化水平，进而抑制PI3K/AKT信号转导通路有关。通过基因转染和筛选建立稳定过表达Cav-1的MCF-7细胞株，我们发现Cav-1可以显著增加多西他赛对MCF-7细胞增殖的抑制作用，并且与对照组和空载体组相比，Cav-1联合多西他赛可以使MCF-7细胞促凋亡蛋白Bax表达增高和抑制凋亡蛋白Bcl-2表达降低，并具有更低的AKT磷酸化水平，两者具有协同作用。由此可见，Cav-1 过表达可以通过抑制AKT磷酸化，阻止PI3K/AKT信号转导通路的活化，从而抑制乳腺癌细胞的生长和增殖，增强其对多西他赛的化疗敏感性。

综上所述，本研究将Cav-1和多西他赛结合有效地促进了乳腺癌细胞的凋亡及其对化疗药物的敏感性，为寻找乳腺癌新的药物靶标及为个体化治疗提供了实验依据。基因免疫治疗协同放化疗的治疗策略将会成为肿瘤治疗新的热点,具有良好的应用前景和新药开发潜力。

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Effect and potential mechanism of Cav-1 in Docetaxel inhibiting breast cancer MCF-7 cell proliferation

LI Ying1,YIN Liangwei2,LIU Jiwei1, LIU Peng2

(1.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China；2.Department of Oncology, Dalian Municipal Central Hospital Affiliated of Dalian Medical Universty, Dalian 116021, China)

Objective To investigate the effect and potential mechanism of Cav-1 (Cav-1) on the proliferation inhibiting of breast cancer MCF-7 cell by Docetaxel. Methods The transfection group was established by stable transfection of pcDNA3.1-Cav-1 into MCF-7 cells, while the vector group (pcDNA3.1 vector transfected) and control group (non-transfection MCF-7 cells) were used as control. The Cav-1 expression of MCF-7 cells treated by Docetaxel was detected by Real-time PCR and Western-blot. CCK-8 assay was used to analyze the cell proliferation. The expression of Bax and Bcl-2 proteins and the activation of PI3K/AKT signal pathway were examined by Western-blot. Results The expression of Cav-1 in MCF-7 cells was gradually enhanced with the increasing of Docetaxel concentration in the range of 5-40 μg/mL.The inhibitory rate of cell proliferation in Cav-1 transfection group was significantly higher than that of the control groups after Docetaxel treatment (P<0.01). Compared with the control groups, Bax expression increased and Bcl-2 and p-AKT expression decreased in Cav-1 transfection group (P<0.01), while there was no significant difference between the two control groups (P>0.05). Conslusion Docetaxel might inhibit the proliferation of MCF-7 cells by promoting the Cav-1 expression, which can regulate the apoptosis-related protein expression and suppress the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

Cav-1; Docetaxel; breast cancer cells;cell proliferation; gene therapy

国家自然科学基金项目(81302310)

李 颖(1981-)，女，主治医师。E-mail:liying8121@126.com

刘 鹏，主治医师。E-mail：liupeng0823@126.com

10.11724/jdmu.2017.04.02

R737.9

A

1671-7295(2017)04-0318-05

李颖，尹良伟，刘基巍，等.多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响[J].大连医科大学学报，2017,39(4)：318-322.

2017-03-20;

2017-05-16)