高效液相色谱法测定饲料中乳酸钙含量

摘要：建立了飼料中乳酸钙的高效液相色谱分离检测方法。试样用水超声萃取，以甲醇-0.05%磷酸作为流动相，使用光电二极管阵列检测器进行检测。结果表明，乳酸钙在0.0375～1.5 mg/mL内具有良好的线性关系，且相关系数为1.0000，乳酸钙的检出限为0.11 mg/g，定量限为0.36 mg/g，回收率为82.9%～102%，相对标准偏差为0.71～2.2%。该方法定量准确可靠，重复好，回收率高，适用于饲料样品中乳酸钙的日常测定。

关键词：饲料；乳酸钙；高效液相色谱

动物产蛋阶段以及幼仔成长前期阶段对钙的需求较大，而饲料原料中钙含量少，玉米含钙量仅为0.02%，豆粕含钙量为0.33%，需要额外添加矿物质钙才能满足其对钙的营养需要[1]。乳酸钙作为优质钙源，早已经被国家批准作为饲料添加剂用于饲料产品中，有文献表明产蛋鸡在初产后饲喂添加有乳酸钙的饲料，可以提高其产蛋率[2]。目前对饲料以及药品中乳酸钙的检测方法主要为滴定法[3-5]。其原理利用乳酸钙可在热水中迅速溶解， 并离解成钙离子和乳酸根离子，钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应， 以钙—羟酸为指示剂， 用EDT A 标准溶液滴定， 溶液成纯蓝色为滴定终点， 用滴定消耗的EDTA 的体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。由于饲料中常含有多种钙源，如碳酸氢钙，甲酸钙，乳酸钙等均易溶于水，其他钙源容易对滴定法造成干扰，造成定量不准确。高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高等特点，是常用的检测方法，已经被用于保健品中多种钙源的分离检测[6]。目前利用高效液相色谱法测定饲料中乳酸钙的检测方法还未见相关报道。本文采用高效液相色谱建立起简单、快速， 准确的饲料中乳酸钙分离检测技术。该方法的建立可为饲料产品中乳酸钙的生产、应用提供有效的技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪配光电光电二极管阵列检测器（美国Waters公司）；DS-8510超声波发生器（上海生析超声仪器有限公司）；Milli Q超纯水制备器（美国Milipor公司）

甲醇，色谱纯（山东禹王实业有限公司），其它试剂为分析纯。

乳酸钙（纯度≥98.0%，含水率为25%）购于上海源叶生物有限公司。

1.2 标准储备液和工作溶液配制

乳酸钙标准储备液的配制：准确称取标准品1.0g，用超纯水溶解并定容至100 mL，配制成浓度为7.5 mg/mL的标准储备液。

标准工作溶液的配制：将乳酸钙的标准储备液采用逐级稀释的方法配制浓度从0.0375 mg/mL到1.5 mg/mL之间的系列标准工作溶液，所有标准储备液和标准工作溶液均置于冰箱中0 ℃ ～ 4 ℃温度下保存。

1.3 样品前处理

称取饲料样品0.1g（精确至0.0001g）于100 mL的烧杯中，加入50 mL超纯水，于超声波振荡器中超声萃取20 min后，转移至100 mL容量瓶中，加入200 g/L乙酸锌溶液和100 g/L亚铁氰化钾溶液各1 mL沉淀蛋白，超纯水混匀定容至刻度。提取液经10000 r/min离心5 min后，取上清液，以0.45 μm滤膜过滤，滤液供分析用。

1.4 色谱条件

色谱柱：XB-C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Welch公司）；柱温： 35℃；检测波长210 nm；流速1.0 mL/min；进样量25 μL。流动相：A，0.05%磷酸溶液；B，甲醇。梯度洗脱程序：0～9.0 min，100%A；9.0～9.1 min，100%A ～40%A ； 9.1～12 min，保持40%A ； 12.0～12.1 min，40%A ～100%A；12.1～15 min，保持100%A。

2 结果与讨论

2. 1 色谱条件优化

C18色谱柱以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS），固定相较为稳定，被广泛运用。本方法采用C18柱可以很好地将乳酸钙与其它化合物分离。同时实验比较了甲醇/水和甲醇/0.05%磷酸溶液两种流动相体系，在甲醇/0.05%磷酸溶液流动相体系下，目标物乳酸钙具有更好的峰型，因而选择后者作为流动相。乳酸钙标准溶液色谱图、饲料空白样品色谱图和饲料样品加标色谱图见图1。

2. 2 前处理条件优化

乳酸钙具有较好的水溶性，实验结合超声波振荡器可充分萃取饲料样品中的乳酸钙。提取液中的蛋白质等化合物可能会对测定样品中的乳酸钙产生干扰，实验通过选用乙酸锌和亚铁氰化钾作为沉淀剂，降低了其他化合物对检测准确性的影响。

2.3 线性方程、线性关系、检出限及定量限

配制乳酸钙各浓度为0.0375 mg/mL到1.5 mg/mL之间的系列标准工作溶液，以乳酸钙的峰面积对浓度进行线性回归，线性方程、相关系数、检出限及定量限。结果表明，乳酸钙在0.0375 mg/mL～1.5 mg/mL内具有很好的线性关系，相关系数r为0.9995。以3倍信噪比（S/N=3）为检出限，以10倍信噪比（S/N=10）为定量限，乳酸钙的检出限为0.11 mg/g，定量限为0.36 mg/g。

2.4 回收率和精密度

在优化后的测试条件下，取空白饲料样品进行加标回收率测试，加标水平分别为103 mg/g，316 mg/g，632 mg/g，每个水平重复分析6次。从该方法的加标回收率为82.9%～102%，相对标准偏差RSD为0.71～2.2%。结果表明，该方法适用于饲料中乳酸钙的日常分析检测。

2.5 实际样品分析

应用本方法对一市售乳酸钙阳性饲料样品进行检测，重复性条件下测定六次，含量分别为638 mg/g，641 mg/g，639 mg/g，645 mg/g，634 mg/g，636 mg/g，相对标准偏差为0.61%。

3 结论

本文采用超声萃取法结合高效液相色谱-光电二极管阵列检测器，建立了饲料中乳酸钙含量的测定方法。该方法操作简单，准确可靠，灵敏度高，适用于饲料样品中乳酸钙含量的测定。

作者简介：

白洋（1987-11），男，内蒙古自治区呼和浩特市，天津中医药大学硕士研究生，助理工程师，研究方向：食品与饲料安全检测.