麦秆碱预处理和同步糖化发酵工艺优化研究

崔茂金，李长恭，祝 勇，邓月娥

(河南科技学院化学化工学院, 河南 新乡 453003)

麦秆碱预处理和同步糖化发酵工艺优化研究

崔茂金，李长恭，祝 勇，邓月娥

(河南科技学院化学化工学院, 河南 新乡 453003)

通过响应面法和正交实验分别优化了麦秆的碱预处理工艺条件和同步糖化发酵工艺条件。首先以麦秆为底物通过Box-behnken设计研究了预处理温度、NaOH质量分数、预处理时间和底物质量浓度对总还原糖含量的影响；然后通过正交实验对碱预处理麦秆的同步糖化发酵工艺进行优化。结果表明：最佳碱预处理工艺条件为预处理温度137.64℃、NaOH质量分数6.72%、预处理时间41.93 min和底物质量浓度9.23 g/L，此时总还原糖含量最高，为496.00 mg/g，为未预处理底物的5.12倍，说明碱预处理可以较好地提高麦秆的糖化率；最佳同步糖化发酵工艺条件为发酵温度39℃、酵母接种量0.1%、酶质量浓度0.2 g/L和发酵时间2 d，此时乙醇含量最高，为22.84 g/L。

麦秆；碱预处理；同步糖化发酵；乙醇；优化

我国《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006—2020年)》中指出，农林生物质综合开发利用是今后国家重点发展领域——农业中优先发展的主题。木质纤维素生物质如农作物秸秆、树叶、草等资源丰富，廉价可再生。但是大量的木质纤维素生物质被丢弃或者焚烧，没有得到充分的利用，这不仅浪费了能源，而且污染了环境。如果将木质纤维素生物质转化为清洁能源如乙醇、生物柴油、氢气，不仅可以缓解能源危机，而且可以减少环境污染，可以取得一举两得效果[1]。

木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素3部分构成。半纤维素结合在纤维素和木质素中，木质素包围着纤维素和半纤维素，这种结构使其自身具有难溶性和高结晶度，从而使得木质纤维素生物质很难直接被酶解和发酵。所以木质纤维素生物质在转化为能源前，必须要对其进行预处理。预处理后木质纤维素结构变得疏松，增大了酶与纤维素的接触面积，从而有效地提高酶解效率[2-4]。常见的木质纤维素预处理方法有物理方法、化学方法、物理化学方法和生物方法[5-9]。木质纤维素发酵制乙醇工艺主要有分步糖化发酵、同步糖化发酵、半同步糖化发酵和同步糖化共发酵4种方式[10]。同步糖化发酵是一种常用有效的木质纤维素生物质转化为乙醇的方法，它将预处理后的木质纤维素生物质的酶解和发酵在同一容器中同时进行，酶解产生的糖立即被用来发酵产乙醇。同步糖化发酵可以避免酶解产糖的增加对酶活性的抑制，从而提高了酶解效率和乙醇产率，而且缩短了酶解时间和发酵时间，从而降低了酶解、发酵成本[11-15]。

基于此，本研究以稀碱预处理的麦秆为底物进行同步糖化发酵。首先利用Box-behnken设计对麦秆的碱预处理工艺进行优化，然后以最佳碱预处理条件下的麦秆为底物，用正交实验对底物的同步糖化发酵工艺进行优化。利用X-射线衍射和红外光谱对原料、碱预处理的底物和发酵后的底物进行表征。

1 材料与方法

1.1 实验材料

麦秆于2015年5月取自新乡市郊区，自然晾干，机械粉碎后在105℃下烘干至恒重，备用。麦秆中灰分含量为8.89%。安琪耐高温酿酒高活性干酵母，购于安琪酵母股份有限公司；纤维素酶，购于西安沃尔森生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

JY-6A恒温搅拌油浴锅，SHA-C水浴恒温振荡器，FA1004电子天平，WFJ7200可见光分光光度计，DF-101S数显集热式磁力搅拌器，FTRI-7600红外光谱仪，DX-2700B X-射线衍射仪。

1.2 实验方法

1.2.1 麦秆碱预处理

分别称取不同质量麦秆粉于圆底烧瓶中，然后分别加入20 mL不同质量分数的NaOH溶液，将圆底烧瓶在恒温搅拌油浴锅中不同温度下加热不同时间，冷却后测定总还原糖含量。离心，取沉淀水洗至中性，105℃干燥3 h，备用。每组实验重复3次，取平均值。总还原糖含量的测定采用苯酚-浓硫酸法[16]。

1.2.2 同步糖化发酵

准确称取1 g干燥的碱预处理麦秆于100 mL三角瓶中，然后分别加入45 mL pH为4.8的0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液配制的纤维素酶液，然后加入5 mL用葡萄糖活化的酵母，在不同温度下发酵不同时间，发酵结束后测定乙醇含量。每组实验重复3次取平均值。乙醇含量的测定采用重铬酸钾法[17]。

1.2.3 样品的表征

1.2.3.1 结晶度分析

原料、预处理样品和发酵样品的结晶度可通过X-射线衍射仪进行测定。测定时扫描步长0.02(°)/s，扫描范围5°～60°。

在前期实验的基础上，根据Segal公式计算样品的相对结晶度[18]：

CrI=(I002-Iam)/I002×100%

式中：CrI表示相对结晶度，I002为002面衍射峰的极大强度(2θ=22.5°)，Iam为衍射角18°时非结晶背景的散射强度。

1.2.3.2 红外分析

原料、预处理样品和发酵样品的FT-IR谱图在红外光谱仪上测定，波数扫描范围为4 000～400 cm-1，扫描32次。

2 结果与讨论

2.1 麦秆碱预处理的响应面优化实验

在前期实验基础上，根据Box-behnken中心组合实验设计原理，以预处理温度(X1)、NaOH质量分数(X2)、预处理时间(X3)和底物质量浓度(X4)为因素，总还原糖含量(Y)为指标，设计了四因素三水平的响应面实验。响应面实验因素与水平见表1，响应面实验设计及结果见表2。

表1 响应面实验因素与水平

表2 响应面实验设计及结果

应用Design-expert软件处理表2数据，经回归拟合得到麦秆碱预处理工艺条件的回归方程：

表3 回归分析

注：P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著。

对回归方程求一阶偏导数得：X1=0.441，X2=0.179，X3=0.247，X4=-0.103。得到麦秆的最佳碱预处理工艺条件为预处理温度137.64℃、NaOH质量分数6.72%、预处理时间41.93 min和底物质量浓度9.23 g/L，此时总还原糖含量为496.00 mg/g，为未预处理底物的5.12倍(未处理的麦秆中总还原糖含量为96.91 mg/g)，说明碱预处理可以较好地提高麦秆的糖化率。

2.2 同步糖化发酵正交优化实验

以最佳条件下碱预处理的麦秆为底物，利用正交实验优化同步糖化发酵条件。在前期实验的基础上，选取发酵温度(A)、酵母接种量(B)、酶质量浓度(C)和发酵时间(D)4个条件为因素，乙醇含量为指标，设计了四因素三水平正交实验，正交实验因素水平见表4。

表4 正交实验因素水平

正交实验设计及结果见表5。从表5可以看出，4个因素对碱预处理的麦秆同步糖化发酵影响的主次顺序为发酵温度(A)>酵母接种量(B)>酶质量浓度(C)>发酵时间(D)。最佳组合为A3B1C1D1，即发酵温度为39℃、酵母接种量为0.1%、酶质量浓度为0.2 g/L和发酵时间为2 d。在最佳条件下做验证实验，乙醇含量为22.84 g/L。

表5 正交实验设计及结果

正交实验方差分析见表6。从表6可以看出，各因素对碱预处理的麦秆同步糖化发酵影响的主次顺序为发酵温度(A)>酵母接种量(B)>酶质量浓度(C)>发酵时间(D)，这与极差分析结果是一致的。发酵温度对碱预处理的麦秆同步糖化发酵影响极显著，酵母接种量和酶质量浓度影响显著，而发酵时间影响不显著。

表6 正交实验方差分析

注：F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9；**极显著，*显著。

2.3 麦秆原料、预处理样品和发酵样品的表征

2.3.1 结晶度分析

生物质的结晶度是影响其酶解和发酵效率的重要因素。许多研究表明由于预处理能降解部分半纤维素和木质素，从而改变了纤维素的结晶度。为了研究麦秆原料、碱预处理样品和发酵样品结晶度的变化，对上述3个样品进行了X-射线衍射分析，并根据Segal公式计算结晶度。3个样品的XRD谱图如图1所示。

从图1可以看出，麦秆经碱预处理和发酵后，其在2θ=16°和2θ=22.5°的衍射峰强度明显增加，尤其是代表结晶区强度的002面衍射峰(2θ=22.5°)强度增加得更为明显。这是因为预处理使得麦秆中的半纤维素和木质素被去除，从而使得纤维素相对含量增加。通过Segal公式计算可知麦秆原料的相对结晶度为66.07%，碱预处理样品的相对结晶度为47.36%，发酵样品的相对结晶度为40.29%。这是因为碱预处理过程中，由于半纤维素和木质素被去除，使得预处理样品中结晶态纤维素结构变得松散，导致其相对结晶度降低。糖化发酵样品的结晶度降低是因为半纤维素和木质素的去除使得更多的纤维素暴露在表面，提高了酶的可及度，进而提高了酶解发酵效率。

图1 麦秆原料(UP)、碱预处理样品(AP)和发酵样品(AF)的XRD谱图

2.3.2 红外分析

对麦秆原料、碱预处理样品及发酵样品进行红外分析，结果如图2所示。

图2 麦秆原料(UP)、碱预处理样品(AP)和发酵样品(AF)的FT-IR谱图

3 结 论

本文利用响应面法和正交实验分别优化了麦秆的碱预处理工艺和同步糖化发酵工艺，得出如下结论：

(1)最佳碱预处理工艺条件为预处理温度137.64℃、NaOH质量分数6.72%、预处理时间41.93 min 和底物质量浓度9.23 g/L，此时总还原糖含量最高，为496.00 mg/g，为未预处理底物的5.12倍，说明碱预处理可以较好地提高麦秆的糖化率。

(2)最佳同步糖化发酵工艺条件为发酵温度39℃、酵母接种量0.1%、酶质量浓度0.2 g/L和发酵时间2 d，此时乙醇含量最高，为22.84 g/L，说明碱预处理可以有效地提高麦秆转化为乙醇的效率。

(3)XRD谱图表明碱预处理样品和发酵样品中纤维素的结晶度降低，FT-IR谱图表明碱预处理样品和发酵样品在3 446、2 918、1 646 cm-1处的特征吸收峰强度都增大了。

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Optimizationofalkalipretreatmentandsimultaneoussaccharificationandfermentationprocessofwheatstraw

CUI Maojin, LI Changgong, ZHU Yong, DENG Yue’e

(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, Henan, China)

Response surface methodology and orthogonal experiment were used to optimize alkali pretreatment conditions and simultaneous saccharification and fermentation conditions of wheat straw. Firstly, the effects of pretreatment temperature, NaOH mass fraction, pretreatment time and substrate mass concentration on the content of total reducing sugar were studied by Box-behnken design using wheat straw as substrate. Then simultaneous saccharification and fermentation conditions of wheat straw pretreated by alkali were optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal alkali pretreatment conditions of wheat straw were obtained as follows: pretreatment temperature 137.64℃, NaOH mass fraction 6.72%, pretreatment time 41.93 min and substrate mass concentration 9.23 g/L. The maximum content of total reducing sugar was 496.00 mg/g under the optimal alkali pretreatment conditions, which was 5.12 times of that from raw materials, indicating that alkali pretreatment was necessary to improve the saccharification efficiency of wheat straw. The optimal simultaneous saccharification and fermentation conditions of wheat straw pretreated by alkali were obtained as follows: fermentation temperature 39℃, yeast inoculation 0.1%, enzyme mass concentration 0.2 g/L and fermentation time 2 d. The maximum of ethanol content was 22.84 g/L under the optimal simultaneous saccharification and fermentation conditions.

wheat straw; alkali pretreatment; simultaneous saccharification and fermentation; ethanol; optimization

2016-12-28；

：2017-06-01

崔茂金(1980)，男，讲师，博士，研究方向为农林生物质资源化(E-mail)cuimaojin@163.com。

X712;S216.2

：A

1003-7969(2017)08-0098-05

生物工程