DHA-丝裂霉素C偶联前药的制备及角膜透过性研究

陈 卓，石 蕊，谭李玉，张宇佳

(1.西安医学院 药学院，西安 710021； 2. 陕西省人民医院，西安 710068)

综合利用

DHA-丝裂霉素C偶联前药的制备及角膜透过性研究

陈 卓1，石 蕊2，谭李玉1，张宇佳1

(1.西安医学院 药学院，西安 710021； 2. 陕西省人民医院，西安 710068)

为了降低丝裂霉素C(MMC)在治疗翼状胬肉时经角膜吸收所导致的副作用，将其与DHA偶联为前药DHA-MMC。经离体角膜透过性实验及体外释放实验，结果发现：增大的相对分子质量可阻断MMC的角膜吸收，以避免其眼内副作用；MMC可以前药(DHA-MMC)形式积聚在眼表后逐渐释放MMC以产生活性。

DHA；前药；DHA-MMC；翼状胬肉

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是一种存在于核桃油、橄榄油、玉米油、芥花油、葵花籽油等油脂中的多烯类脂肪酸[1]，其不仅可以作为营养物质，在药物化学领域还常常被用于制备前药。当PUFAs用于前药时具有以下3个特点：①PUFAs本身就是人体所需的营养成分之一,可以较大剂量摄入，具有较好的代谢活性以及无毒性、无免疫原性[2]；②二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等PUFAs具有肿瘤抑制活性[3]；③PUFAs具有肿瘤靶向性[4]。因此，PUFAs是一种理想的肿瘤靶向载体，可以与抗肿瘤药物通过化学法制备为前药。

眼表长期受到外界刺激，如高紫外线、高风沙、雾霾等，易在睑裂部球结膜引起纤维血管组织赘生性病变，因其酷似昆虫的翅膀而得名翼状胬肉。翼状胬肉是西北地区最常见的眼表疾病之一。翼状胬肉严重危害人们的视力健康，其生长浸润角膜会导致散光、炎症、甚至失明。翼状胬肉组织具有很强的肿瘤样特征，目前临床上多采用手术切除法，且必须在术中、术后联用丝裂霉素C(MMC)等高毒性抗代谢药物，否则单纯术后会出现强复发，其新生成组织由于手术刺激生长更快，波及更广，必须使用抗肿瘤药物杀灭、抑制手术切除后眼表残存的成纤维细胞[5]。但是，术中、术后在眼表长期施用的MMC会通过角膜吸收进入眼球，导致眼内组织如晶状体、玻璃体及视网膜等受损[5]。这种现象即MMC在翼状胬肉治疗中的主要副作用：在眼表靶点外通过角膜吸收导致的眼内副作用。

角膜是介于眼表与眼内的保护屏障，进入眼内的药物必须通过角膜吸收。角膜上皮细胞层厚约 50 μm，其细胞间以桥小体相接，构成致密的质膜，使相对分子质量达到500以上的化合物难以通过角膜吸收[6]。本研究将MMC与DHA这一无毒、无免疫原性较大分子化合物通过化学合成的方法制备为较大分子前药DHA-MMC，从而使药物的相对分子质量由单独MMC时的334提高至649，从而难以透过角膜形成眼内吸收，降低了眼内副作用，并在蓄积于结膜及翼状胬肉组织后逐渐水解释放MMC起效。同时，利用PUFAs的肿瘤抑制性和靶向性增强DHA-MMC的翼状胬肉组织选择性及抑制性。本文研究了所获得的较大分子前药DHA-MMC的角膜透过性及体外释放性，验证了课题设计，有望获得一种新颖的翼状胬肉治疗药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与试剂

丝裂霉素C为化学纯(Sigma-Aldrich)；DHA(Sigma-Aldrich)；N-甲基吗啉为分析纯(上海阿拉丁生化科技)；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC-HCl)为分析纯(上海源叶生物科技)；N-羟基丁二酰亚胺为分析纯(上海源叶生物科技)；双蒸水;柱层析所使用薄层硅胶为硅胶H(青岛海洋化工)；家兔(购于市场)；其他常见有机溶剂、试剂均为分析纯，必要时干燥。

1.1.2 实验仪器

FD-1000型冷冻干燥机(日本东京理化株式会社)；1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦)；UV-1780 型紫外分光光度计(日本岛津)；PSL-1810型磁力搅拌低温槽(日本东京理化株式会社)；RYJ-6B型FRANZ扩散池(上海黄海药检仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 DHA-MMC的制备机理(见图1)

DHA-MMC是通过将DHA的羧基与MMC上的伯氨基以酰胺键的方式连接。采用了1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC-HCl)作为缩合剂，先将DHA与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)缩合为反应性质极为活泼的DHA活性酯(DHA-NHS)后，再使其与MMC缩合成酰胺键。

图1 DHA-MMC的制备

1.2.1.1 DHA-NHS的制备

向25 mL圆底瓶中加入DHA 329 mg(1 mmol)，NHS 173 mg(1.5 mmol)，EDC-HCl 574 mg(3 mmol)及2 mL N-甲基吗啉，加入二氧六环15 mL溶解后，在N2保护下20℃反应24 h，减压蒸去溶剂，剩余物用氯仿溶解，2 mol/L盐酸30 mL洗涤，氯仿层干燥后蒸干，得黄色油状物171 mg，即DHA-NHS，得率40.2%。DHA-NHS在N2保护下保存。

1.2.1.2 DHA-MMC的制备

向25 mL圆底瓶中加入DHA-NHS 106.3 mg(0.25 mmol)，0.03 mol/L HBS缓冲液(pH 7.4)10 mL，搅拌下加入MMC 83.5 mg(0.25 mmol)，期间监测pH并按需加入0.5 mol/L氢氧化钠水溶液维持pH 7.4；然后搅拌12 h后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为环己烷-乙酸乙酯(体积比100∶1))得黄白色产物143.1 mg，即DHA-MMC，得率75.1%。

1.2.2 DHA-MMC的体外释放研究

1.2.2.1 人工泪液STF的配制

取NaCl 6.78 g，KCl 1.38 g，NaHCO32.18 g加入1 L容量瓶中，并加入约500 mL双蒸水溶解，取CaCl20.084 g溶解于约200 mL双蒸水后搅拌下加入上述容量瓶中，定容即得。

1.2.2.2 MMC及DHA-MMC含量的测定

参考杨西晓等[7]的方法，采用HPLC进行检测。色谱条件为：C18色谱柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)，乙腈-磷酸缓冲液(体积比15∶85)，流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温37℃，测定波长为365 nm。DHA-MMC、MMC对照品配制方法为：精密称取DHA-MMC、MMC各25 mg，分别置于50 mL容量瓶中，加人工泪液稀释至刻度后，即得0.5 mg/mL 对照品溶液。

1.2.2.3 DHA-MMC的体外释放性的测定

以人工泪液10 mL为溶出介质，向其中加入DHA-MMC 50 mg，控制其温度为(37±1)℃，磁力搅拌器转速约为60 r/min。每隔1 h取释放液0.3 mL并补加人工泪液0.3 mL，释放液经0.2 μm微孔滤膜过滤后直接用HPLC测定，使用外标法计算释放出的MMC的质量浓度。

1.2.3 DHA-MMC的离体角膜透过性研究

将家兔耳缘静脉注射空气致死。在死后立即取出眼球，剪下前节，小心分离出角膜，并除去巩膜、虹膜、睫状体等多余组织，期间严格避免划伤角膜组织。将新鲜离体角膜分别小心固定在两套FRNAZ扩散池的供给池和接收池之间，使上皮层面向供给池，在接收池中加入新鲜配制的人工泪液4.5 mL，在供给池中加入6.5 mg/mL(1 μmol/mL)的DHA-MMC人工泪液溶液。温度控制在(37±1)℃，转速控制在(200±25)r/min。待8 h后在接收池中取样4.5 mL。样液经0.2 μm微孔滤膜过滤后，用1.2.2.2 的方法测定DHA-MMC的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 DHA-MMC的体外释放研究结果

DHA-MMC在人工泪液中的体外释放性采用了1.2.2的方法进行测定，其结果见表1。如表1所示，DHA-MMC在人工泪液中呈零级缓慢释放，这说明将MMC制备成DHA化的前药(DHA-MMC)可以有效控制药物的释放，达到缓释的目的。

表1 DHA-MMC的体外释放

2.2 DHA-MMC的离体角膜透过性研究结果

翼状胬肉病发于眼表，MMC的副作用由角膜吸收入眼导致。通过1.2.3方法考察了DHA-MMC的离体角膜透过性。经纯品DHA-MMC进样比较，发现HPLC检测限上未检出经角膜透出的 DHA-MMC。表明增大相对分子质量可阻断MMC的角膜吸收，以避免其眼内副作用。

2.3 DHA-MMC的制备方法的选择

DHA-MMC是通过将DHA的羧基与MMC上的伯氨基以酰胺键的方式连接。但是，由于DHA上的羧基的反应活性较低，无法直接与MMC上的伯氨基反应形成酰胺键，我们比较了酰氯法、直接缩合法后，选择采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐作为缩合剂，先将DHA与 N-羟基丁二酰亚胺缩合为反应性质极为活泼的DHA活性酯(DHA-NHS)后，再使其与MMC缩合成酰胺键。

该法相比酰氯法及直接缩合法的优势在于，DHA活性酯的反应活性远大于酰氯法拟使用的DHA酰氯及直接缩合法使用的DHA本身。因此，虽然此法第一步制备活性酯的得率较低(40.2%)，但基于DHA-MMC的得率相对其他方法较高，使我们最终选择了活性酯法制备DHA-MMC。

2.4 DHA-NHS的制备条件优化

DHA-NHS是制备DHA衍生物的关键中间体，对DHA在医药领域的深入研究有着重要的价值。然而，DHA-NHS的化学性质活泼，本身极不稳定，对制备方法进行考察有一定的研究意义。在DHA-NHS的制备过程中，所生成的产物有可能随反应时间的延长及反应温度的升高发生分解。因此，以产物得率为指标，对反应时间与反应温度进行了考察，结果见表2。如表2所示，较好反应条件为：反应温度20℃，反应时间24 h。

表2 反应温度与反应时间对DHA-NHS得率的影响

3 结 论

设计并通过两步反应合成了前药DHA-MMC，通过离体角膜透过性研究表明其角膜吸收已被阻断。通过体外释放研究表明MMC可以前药(DHA-MMC)形式积聚在眼表后逐渐释放MMC以产生活性，从而获得了一种减少MMC在翼状胬肉治疗中经角膜吸收导致的眼内副作用，具更大治疗窗的丝裂霉素C前药。

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PreparationofDHA-mitomycinCprodruganditspermeabilityoncorneal

CHEN Zhuo1, SHI Rui2, TAN Liyu1, ZHANG Yujia1

(1. College of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China； 2. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, China)

In order to reduce the side effects of mitomycin C(MMC) by corneal absorption in the treatment of pterygium,the prodrug DHA-MMC was preparaed by chemical coupling with DHA and MMC. The results of the corneal permeability experiment and in vitro release experiment showed that increased relative molecular weight could block MMC’s corneal absorption, so as to avoid its ocular side effects. The prodrug DHA-MMC could amass in ocular surface and then release the MMC to generate activity.

DHA; prodrug; DHA-MMC; pterygium

2017-01-20；

：2017-04-12

陕西省教育厅专项科研计划项目(15JK1620)

陈 卓(1985)，男，讲师，硕士，主要从事药物化学研究工作(E-mail)352304625@qq.com。

R77; R917

：A

1003-7969(2017)08-0108-04