快速PCR技术鉴别中药材蛤蚧的方法研究△

蒋超，赵群，金艳，袁媛*，赵玉洋

(1.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.皖西学院 化学与生命科学系，安徽 六安 237012)

·专题·

快速PCR技术鉴别中药材蛤蚧的方法研究△

蒋超1，赵群2，金艳1，袁媛1*，赵玉洋1

(1.中国中医科学院 中药资源中心，北京100700；2.皖西学院 化学与生命科学系，安徽 六安237012)

目的：建立简单快速鉴别蛤蚧的特异性PCR方法。方法：对比蛤蚧及其伪品细胞色素C氧化酶I亚基基因(CO I)序列，设计蛤蚧特异性PCR鉴别引物，优化特异性PCR条件，对蛤蚧及其7种常见混淆品进行扩增及荧光检测。结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，所有蛤蚧药材均能扩增出约400bp的特异性条带，加入SYBR Green I染料后，在365nm下出现强烈绿色荧光，混伪品不具特异条带和绿色荧光，鉴别操作可在30min内完成。结论：快速PCR结合荧光染料检测可快速鉴别蛤蚧及其常见伪品，为蛤蚧的快速鉴定提供了新的思路和方法。

快速PCR；分子鉴定；蛤蚧；荧光检测

中药蛤蚧来源于壁虎科动物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus.的干燥体，在临床上主要用于肺肾不足、虚喘气促、劳嗽咳血等。以蛤蚧为主要原料的中成药，如蛤蚧精、蛤蚧补肾丸、蛤蚧定喘丸等应用广泛，用量甚大。近年来随着蛤蚧资源的缩减，蛤蚧伪品时有出现，市场上出现过的蛤蚧伪品多达18种，包括东方蝾螈、中国瘰螈、变色树蜥、无蹼壁虎、多疣壁虎、红螺疣螈、喜山岩蜥、青海沙蜥、石龙子、变色沙蜥等[1-3]。对其中一些品种，蛤蚧正品与之形态学特征差别细微，传统的方法难以对其药材进行鉴定[4]。为确保药材市场中蛤蚧的质量及其临床疗效，需要建立快速、准确的方法进行鉴定。

分子生物学技术的发展为动物类中药的鉴别提供了新的技术手段，尤其是特异性PCR技术，因其客观、准确的优点已用于蛤蚧[2]、蛇类[5-6]、鹿茸[7]、蛤蟆油[8]等动物类中药的真伪鉴别。然而相对传统方法其实验周期较长，特别是完成PCR反应后还需电泳与成像等步骤，严重制约了分子鉴定技术的进一步应用。快速PCR是在特异性PCR技术基础上的进一步发展，通过结合DNA快速提取[9]、快速PCR扩增和荧光检测技术，能在30～40 min内实现真伪鉴别。快速PCR技术自从在金银花[10]和蛇类药材[11]应用以来快速发展，已用于鱼腥草[12]、杜仲[13]、西红花[14]、绞股蓝[15]、人参[16]、艾纳香[17]、菟丝子[18]等中药的真伪鉴定与质量控制。本研究拟通过利用碱裂解法快速提取DNA，优化特异性PCR反应程序，进行快速扩增，结合SYBR Green I荧光染料对真伪鉴别结果进行肉眼检测，将蛤蚧PCR鉴制时间控制在40 min内，为实现蛤蚧的现场DNA分子鉴别提供技术保障。

1 仪器与试药

1.1仪器

PCR仪：VeritiTM型(AppliedBiosystem公司)、GeneAmp9700型(AppliedBiosystem公司)、PTC-100型(Gene公司)、TC-512型(Techne公司)、Mastercycler型(Eppendorf公司)；5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；VORTEX-2GENIE漩涡震荡仪(Scientificindustries公司)；PowerPacTM型电泳仪(Bio-Rad公司)；HE99X-15-1.5型电泳槽(Hoefer公司)；SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司)；WD-9403C型紫外仪(北京市六一仪器厂)。

1.2材料

选取来自于不同产地的蛤蚧正品及7种蛤蚧类伪品共79份材料进行快速PCR鉴别研究。样品采自安徽亳州、广西玉林、成都荷花池等药材市场，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。见表1。

表1 材料详表

1.3试剂

不同特性TaqDNA聚合酶：低保真的rTaq(Takara公司)、中度保真的SpeedStarHSTaq(Takara公司)、高度保真的Q5TaqDNA聚合酶(NEB公司)；I-52×High-FidelityMasterMix预混液(北京擎科新业生物技术有限公司)；琼脂糖(Promega公司)；溴化乙啶(Fluka公司)；DL2000DNAMarker(Takara公司)；10000×SYBRGreenI(Invitrogen公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1引物设计

2.1.1序列比对 从NCBI数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中下载蛤蚧(HM362960.1、F920686.1)及其可能的伪品东方蝾螈(CynopsorientalisEU880311.1)、变色树蜥(KC016067.1)、无蹼壁虎(EU417712.1)、中国壁虎(GekkochinensisKP666135.1)、青海沙蜥(PhrynocephalusvlangaliiKF691719.1)、喜山岩蜥(LaudakiahimalayanaHM362935.1)、变色沙蜥(KF691736.1)、丽斑麻蜥(HQ733935.1)的CO I序列，对于网上无序列的中国瘰螈、红瘰疣螈、中国石龙子样品和蛤蚧正品使用通用引物LCO1490/HCO2198[19]，按照标准程序(见表2)进行扩增，并进行双向测序，序列经拼接后与下载的序列一起利用Clustal W程序进行多重序列比对，选择蛤蚧与其伪品差异大的区域进行引物设计。

2.1.2引物设计 使用Premier Primer5.0(http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/)设计特异性PCR鉴别引物，调整参数使引物为3′末端位于蛤蚧与其伪品差异区域，PCR产物长度为100～400bp，Tm值为55～65℃，引物命名为GeJie.F和GeJie.R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.2基因组总DNA的提取

取2g样品，使用Retsch MM400球磨粉碎至能过80目筛，取20mg粉末，使用碱裂解法[9]提取总DNA，所提取DNA稀释10倍用于PCR反应。通用引物对LCO1490/HCO2198用于PCR反应，以检测DNA质量。20μL PCR反应体系包含2μL10×FBI缓冲液、1μL10mmol·L-1dNTPs、0.25μmol·L-1上游及下游引物、1U Speedstar HS Taq酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10mg·mL-1BSA溶液、1μL DNA模板，反应程序见表2。

表2 引物及PCR反应条件

2.3PCR扩增条件的确定

通过调整PCR体系和反应程序确定蛤蚧特异性鉴别的最优条件。25μL初始PCR反应体系包含2.5μL10×PCR buffer、1μL10m mol·L-1dNTPs、0.25μmol·L-1上游及下游引物、1U快速Taq酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10mg·mL-1BSA溶液、1μL(约20ng)DNA模板，PCR反应在VeritiTM型PCR扩增仪上进行。初始反应程序见表2。取PCR反应产物，加入5μL6×Loading buffer(Takara公司)，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

使用蛤蚧鉴别引物对蛤蚧正品及其常见伪品总DNA模板进行扩增，并分别考察退火温度、PCR循环数、模板DNA浓度、变性和退火时间、Taq种类、不同PCR仪对PCR反应稳定性的影响。

2.4PCR产物检测

为达到快速鉴别的目的，PCR产物使用荧光发光的方式进行检测。取PCR扩增产物，置96孔微孔板中，加入2μL100×SYBR Green I，于365nm紫外波长下检测荧光，出现强烈绿色荧光则表明有扩增。

3 结果

3.1蛤蚧特异性鉴别引物的设计

使用ClustalW软件对蛤蚧、东方蝾螈、变色树蜥、无蹼壁虎、中国壁虎、青海沙蜥、喜山岩蜥、变色沙蜥、丽斑麻蜥、中国瘰螈、红瘰疣螈、中国石龙子的COI序列进行多重序列比对，以蛤蚧与伪品具有差异的SNP位点为基础设计引物，蛤蚧预期扩增长度为413bp，见图1。

图1 蛤蚧特异性鉴别引物设计结果

3.2蛤蚧类样品DNA提取

碱裂解法提取的蛤蚧及其伪品总DNA经NanoDrop核酸蛋白仪检测，浓度为(233.6±79.2)ng·μL-1，A260/A280为(1.42±0.17)，符合PCR扩增的要求；由于使用碱裂解法提取的DNA不适宜使用凝胶电泳检测[9]，故本文采用通用引物LCO1490/HCO2198检验扩增效率。PCR产物经凝胶电泳检测均可获得约700bp DNA条带，表明碱裂解法对蛤蚧类材料具有良好的提取效果，见图2。

注：M.100 bp DNA ladder；1～4.蛤蚧；5～7.变色树蜥；8～10.变色沙蜥；11～13.丽斑麻蜥；14.红螺疣螈；15～17.中国石龙子；18～22.无蹼壁虎；23.中国瘰螈；24.空白对照(以dd H2O为模板)。图2 LCO1490/HCO2198引物扩增碱裂解法提取DNA结果

3.3快速PCR鉴别条件考察

由于影响特异性鉴别准确性的关键因素包括退火温度、循环数和模板DNA浓度，而决定PCR反应速度的核心因素为循环数和退火/延伸时长，本研究以正品扩增强度和伪品条带有无为指标，依次对退火温度、循环数、DNA浓度、变性/退火时间进行系统考察，同时考察筛选的条件对不同Taq DNA聚合酶及不同PCR扩增仪的耐受性。结果表明，退火温度为63～67℃，循环数为25～35，DNA模板浓度为4～100ng·μL-1，变性时间和退火时间在5～30s时均可准确鉴别蛤蚧及其常见伪品，见表3。在此条件下对不同保真度的Taq酶和不同型号PCR仪均具有耐受性，见表3。而退火温度过低(<61℃)、循环数过大(>40)则会产生假阳性结果，模板浓度过低(<1ng·μL-1)则会产生假阴性结果。最终确定蛤蚧快速PCR鉴别反应条件为95 ℃，1 min；95 ℃，10 s；65 ℃，10 s，30个循环，在Veriti PCR仪上可于30 min内完成PCR反应。

表3 蛤蚧特异性PCR条件考察结果

3.4适用性考察

使用蛤蚧特异性鉴别引物，采用筛选出的体系和PCR条件，对亳州、玉林、成都等不同药材市场的32批正品蛤蚧样品及变色树蜥、变色沙蜥、丽斑麻蜥、红瘰疣螈、中国石龙子、无蹼壁虎、中国瘰螈7种共47批蛤蚧伪品进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，仅蛤蚧正品在250-500bp间产生明亮单一条带，伪品无条带，不同市场来源的正品蛤蚧均产生一致结果，表明该体系能稳定准确地鉴别蛤蚧。

由于凝胶电泳较费时费力，本研究在蛤蚧PCR扩增产物内直接加入2μL100×SYBRGreenI，于365nm紫外灯下肉眼观察，所有蛤蚧正品均产生强烈绿色荧光，而伪品无荧光，可达到快速鉴别目的。见图3～4。

注：A.PCR产物凝胶电泳结果；B.PCR产物加入SYBR Green I后于365 nm紫外下检视结果；M.DL2000 Marker；1～4.蛤蚧；5～7.变色树蜥；8～10.变色沙蜥；11～13.丽斑麻蜥；14.红螺疣螈；15～17.中国石龙子；18～22.无蹼壁虎；23.中国瘰螈；24.空白对照(以dd H2O为模板)。图3 蛤蚧正伪品鉴别结果

注：A.PCR产物凝胶电泳结果；B.PCR产物加入SYBR Green I后于365 nm紫外下检视结果；M.100 bp ladder Marker；1～4.蛤蚧(亳州)；5～20.蛤蚧(玉林)；21～24.蛤蚧(成都)。图4 不同批次蛤蚧鉴别结果

4 分析与讨论

进行DNA分子鉴定的前提条件是正品与混伪品间存在明显的种间序列差异，本研究对正品蛤蚧及来源相近、外观形态相似的7种混伪品COI序列进行分析，发现正伪品序列存在显著差异，系统发育树分析亦呈单系[20]，从而设计特异性引物进行鉴别研究。蛤蚧有两种形态：红斑蛤蚧和灰斑蛤蚧，其中红斑蛤蚧主要为进口，产自泰国、越南等地，量大；灰斑蛤蚧主要产自广西，量很少。为保证方法的适用性，我们采集了广西的灰斑蛤蚧和不同来源的红斑蛤蚧进行实验，结果表明，该方法对红斑和灰斑蛤蚧均能进行鉴别。本研究也对这两种蛤蚧COI片段进行测序，结果发现，其序列没有区别，该结果与张月云等人通过12S测序的结果一致[21]。用于鉴别研究的蛤蚧混伪包括鬣蜥科变色树蜥和变色沙蜥、蜥蜴科丽斑麻蜥、石龙子科中国石龙子、蝾螈科中国瘰螈和红螺疣螈，虽然形态相似，其COI序列差异明显，设计的引物能达到良好的鉴别效果。同属的无蹼壁虎COI序列与蛤蚧序列差异小，为防止鉴别时出现条带产生假阳性，本研究使用较高的退火温度(65℃)，以保障鉴别的特异性；同时，在引物设计上尽量使差异位点位于3′末端，在使用较高的退火温度时，实验使用的几种TaqDNA聚合酶均能很好的对蛤蚧及其混伪品进行鉴别。

为达到快速鉴定的目的，本研究利用碱裂解法提取总DNA，并使用SYBRGreenI荧光染料进行荧光检测。SYBRGreenI能选择性地与双链DNA结合发出强烈绿色荧光，从而监测PCR产物的有无，具有灵敏度高、操作简单的优点，但同时也可与引物二聚体等非特异性产物发生假阳性反应，影响鉴别的准确性。在引物设计时需严格避免二聚体的形成，并通过凝胶电泳进行检测。碱裂解法是一种DNA快速提取技术，能在5～10min内获得足以进行PCR的DNA，已成功用于蛇类、冬虫夏草[22]、桑螵蛸[23]等多种动物药材的DNA提取。本研究表明，碱裂解法也可用于蛤蚧的DNA提取，并且不需要大型仪器，为动物药快速、现场鉴定提供了技术保障。

[1] 朱华，任仁安.18种商品蛤蚧原动物及性状的鉴别[J].广西中医药，1999，22(1)：39-43.

[2] 顾海丰，夏云，徐永莉，等.中药材蛤蚧的特异性PCR鉴定[J].四川动物，2012，31(2)：226-231.

[3]GuHF，XiaY，PengaR，etal.AuthenticationofChinesecrudedruggeckobyDNAbarcoding[J].NatProdCommun，2011，6(1)：67-71.

[4] 王成芳，包永睿，孟宪生，等.蛤蚧药材高效毛细管电泳指纹图谱研究[J].中药材，2010，33(3)：337-339.

[5] 唐晓晶，冯成强，黄璐琦，等.高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品[J].中国药学杂志，2007，42(5)：333-336.

[6] 唐晓晶，冯成强，黄璐琦，等.蕲蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别[J].药物分析杂志，2006，26(2)：152-155.

[7] 王学勇，刘春生，张蓉，等.位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究[J].中国中药杂志，2009，34(23)：3013-3016.

[8]YangXG，WanYQ，ZhouKY，etal.Authenticationofoviductusranaeanditsoriginalanimalsusingmolecularmarker[J].BiologicPharmBull，2002，25(8)：1035-1039.

[9] 蒋超，黄璐琦，袁媛，等.使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究[J].药物分析杂志，2013，33(7)：1081-1090.

[10]蒋超，侯静怡，黄璐琦，等.快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2014，39(19)：3668-3672.

[11]陈康，蒋超，袁媛，等.快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2014，39(19)：3673-3677.

[12]魏艺聪，袁媛，陈建雄，等.快速PCR法鉴别鱼腥草与百部还魂的方法研究[J].中草药，2016，47(12)：2163-2166.

[13]丁铃，赵丹，周涛，等.杜仲药材特异性PCR的鉴定方法研究[J].中药材，2015，38(4)：730-734.

[14]郑琪，蒋超，袁媛，等.基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究[J].中国药学杂志，2015，50(1)：23-28.

[15]魏艺聪，陈建雄，黄泽豪，等.PCR方法快速鉴别绞股蓝与乌蔹莓[J].福建农业学报，2016，31(3)：265-267.

[16]崔占虎，袁媛，张景景，等.基于快速PCR方法的人参属药用植物鉴别研究[J].中药材，2015，38(8)：1634-1638.

[17]赵丹，周涛，袁媛，等.基于特异性PCR和荧光检测技术快速鉴定艾纳香[J].植物研究，2015，38(6)：952-956.

[18]蒋超，崔占虎，袁媛，等.菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究[J].中国中药杂志，2016，41(2)：211-215.

[19]HebertPD，CywinskaA，BallSL.BiologicalidentificationsthroughDNAbarcodes[J].PRoySocLondonB，2003，270(1512)：313-321.

[20]张红印，石林春，刘冬，等.基于COI条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA分子鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化，2014，16(2)：269-273.

[21]张月云，莫新春，曾维铭，等.从12SrRNA基因序列差异分析黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的进化关系[J].广西医学，2006，28(6)：793-796.

[22]王茜，侯飞侠，王艺璇，等.碱裂解法快速提取虫草属真菌DNA研究[J].时珍国医国药，2016，27(4)：995-997.

[23]王茜，侯飞侠，王艺璇，等.基于DNA条形码的桑螵蛸基原动物鉴定研究[J].中国中药杂志，2015，40(20)：3963-3966.

Molecular Authentication of Gecko and Its Adulterants by Rapid Specific PCR

JIANG Chao1，ZHAO Qun2，JIN Yan1，YUAN Yuan1*，ZHAO Yuyang1

(1.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing，100700，China；2.DepartmentofChemistryandLifeSciences，WestAnhuiUniversity，Lu’an，Anhui，237012，China)

Objective：To establish a rapid specific PCR method to authenticate gecko and its adulterants.Methods：Specific PCR primers were designed based on CO I sequences and the annealing temperature of PCR reaction conditions was optimized，which was performed to authenticate gecko and its 7 adulterants combined with fluorescence analysis.Results：Gecko could obtain a 400 bp specific band in electrophoresis and a great green fluorescence was also observed under 365 nm UV lamp，while the adulterants did not.Conclusion：The results indicated that rapid specific PCR combined with SYBR green I fluorescence detection could authenticate gecko and its adulterants rapidly and simply，which provided a new idea and way for gecko rapid identification.

Rapid PCR；molecular authentication；gecko；fluorescence detection

中医药行业科研专项(201407003)

] 袁媛，研究员，研究方向：中药功能基因组研究及中药分子鉴定；Tel：(010)64014411-2956，E-mail：y_yuan0732@gmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.004

2016-08-14)

*[