盐胁迫下沼泽小叶桦土壤细菌数量及种类的变化特征

何小丽，朱 义，崔心红(1.上海市园林科学规划研究院，上海 200232； 2.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232)

盐胁迫下沼泽小叶桦土壤细菌数量及种类的变化特征

何小丽1,2，朱 义1,2，崔心红1*
(1.上海市园林科学规划研究院，上海 200232； 2.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232)

采用稀释平板法及16S rDNA序列比对法对不同NaCl浓度(0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)胁迫下的沼泽小叶桦土壤细菌数量进行统计和种类鉴定。结果发现，NaCl胁迫下沼泽小叶桦土壤细菌数量增加，且随盐浓度提高而递增；但土壤细菌多样性减小，细菌种类主要以芽胞杆菌属(Bacillus)为主。

沼泽小叶桦； 盐胁迫； 土壤细菌

沼泽小叶桦(Betulamicrophyllavar.paludosa)为桦木科桦木属小乔木或灌木，原产地为新疆阿勒泰地区的潮湿盐碱地及盐沼泽附近。由于其高耐盐碱特性，近年来被广泛引种至滨海盐渍地区，可用来作为滨海防护林或盐碱土生物修复最佳植物材料之一。对沼泽小叶桦耐盐碱、耐高温高湿机理的研究较多[1- 3]，而对其根围土壤细菌群落结构的研究则相对较少。土壤细菌群落结构与土壤营养元素转化及植物生长表现密切相关，本研究对不同NaCl浓度下的沼泽小叶桦根围土壤细菌数量及种类进行分析，研究盐胁迫下土壤细菌结构与沼泽小叶桦生长之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的沼泽小叶桦树苗由上海市园林科学规划研究院提供，高度为约60 cm大小一致的1年生组培苗。栽培介质为草炭+蛭石+珍珠岩(体积比为4∶3∶3)。

1.2 处理设计

试验设NaCl浓度4个水平处理，即0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，以空白即盐浓度为0的清水为对照(CK)。重复5次。以0.2%为起始浓度，以后隔天浓度递增0.2%，使各处理于同一天达到预定浓度。

1.3 检测项目

栽培30 d后采集各处理沼泽小叶桦根围土壤混合样品，4 ℃保存。

土壤细菌数量统计。准确称取土壤样品10 g，加入到90 mL生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中混匀作为原液。原液依次按照10-1、10-2浓度梯度进行倍比稀释，分别接种于含有1.5%琼脂粉的牛肉膏蛋白胨培养基上，28 ℃倒置培养48 h，根据菌落特征进行初步分类。挑取形态不同的单菌落划线分离，反复3次获得菌落形态完全一致的纯化菌株，制备甘油管-80 ℃冻存，同时接种于牛肉膏斜面培养基上4 ℃保存。

细菌16S rDNA序列比对。取所分离菌株的48 h平板培养物作为模板，按照如下体系进行细菌16S rDNA PCR扩增，正向引物5′- AGAGTTTGATCCTGGCTC AG- 3′，反向引物5′- TACGGCTACCTTGTTACGACTT- 3′；50 μL体系[4- 5]为：模板2 μL，dNTP(25 mmol·L-1) 4 μL，引物(1 mmol·L-1)各2 μL，10×Taq缓冲液5 μL，Mg2+(25 mmol·L-1) 3 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.6 μL，超纯水31.4 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，循环30次；72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1.5 kbp左右)后，将其TA克隆后进行测序(由invitrogen公司完成)。将测序结果输入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/，利用BLAST软件，将测定得到的基因序列与GenBank数据库中序列进行相似性搜索，确定细菌的种属类别。

2 结果与分析

2.1 对细菌数量的影响

从表1可以看出，随着土壤盐浓度的增加，土壤细菌数量增加。可通过土壤细菌的增殖来减轻植物的盐胁迫程度。

表1 不同NaCl浓度处理沼泽小叶桦根围土壤细菌数量及主要种属

注：同列数据后无相同字母者表示组间差异达显著水平。

2.2 对细菌种类的影响

不施任何盐对照的沼泽小叶桦根围土壤细菌种类较多，有芽胞杆菌属(Bacillus)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、泛菌属(Pantoea)等4类。4种盐胁迫处理的沼泽小叶桦根围土壤细菌种类均为芽胞杆菌属细菌。一定浓度的NaCl盐溶液抑制了沼泽小叶桦根围某些类细菌的生长，促进了根围耐盐细菌的生长及数量的增加。芽胞杆菌属细菌为一类含有内生孢子的杆菌或球菌，可以孢子休眠体的形式度过各种逆境和胁迫环境，为土壤有益菌群。

2.3 沼泽小叶桦的伤害症状

NaCl胁迫下，沼泽小叶桦生长速率降低，随着盐浓度的升高，生长速率降低越明显。当NaCl 浓度为0.2%与0.4%时，植株叶片盐胁迫不明显，叶色与对照植株无显著差别；当NaCl浓度达0.6%、0.8%时，历经18 d生长期后，植株下部老叶开始变黄萎蔫脱落，上部新生叶片较少表现出盐害症状；第26 d，0.8%处理的植株叶片开始大量干枯脱落，31 d后基本全部脱落完。试验结束时对照植株比4种盐胁迫处理的苗高约6 cm。

3 小结与讨论

对照由于土壤盐度低，利于多种细菌生长和繁殖，土壤细菌种类丰富。4个盐胁迫处理土壤盐分较高，抑制了土壤细菌多样性，土壤细菌种类迅速减少，以芽胞杆菌属(Bacillus)细菌居多。已有报道芽孢杆菌在有无盐胁迫条件下均对植物生长具有促进作用[6- 8]，能提高植物的耐盐性，是一类植物促生菌。微生物在受到高渗胁迫等刺激后，在细胞内积累相容溶质，以提高细胞内的渗透压，使细胞在高渗环境中能够进行正常的生理活动。芽胞杆菌是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，其生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。芽胞杆菌以其生长迅速、对营养要求低以及抗性强等特点，在土壤中常以较稳定的类群存在。由于芽胞杆菌富含蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶类，部分菌还可以分解土壤中的不溶性磷酸盐及钾盐，芽胞杆菌不仅有降解土壤中难溶的含磷、含钾化合物的特性，还有报道称芽胞杆菌具有固氮的特性，芽胞杆菌在土壤物质循环和防治植物病害、促进植物生长中起着重要的作用[6- 7]。

综上所述，沼泽小叶桦在较低盐浓度处理的土壤中生长良好，不仅与自身耐盐的生理结构与功能有关，与土壤细菌群落结构变化可能也存在一定的关联。

[1] 王斌，巨波，赵慧娟，等.不同盐梯度处理下沼泽小叶桦的生理特征及叶片结构[J].林业科学,2011,47(10):29- 36.

[2] 王斌.NaCl和Na2SO4胁迫下沼泽小叶桦的生理响应[J].南京林业大学学报(自然科学版),2013,37(1):132- 136.

[3] 王斌,赵慧娟,巨波,等.高温高湿对沼泽小叶桦光合和生理特征的影响及其恢复效应[J].中国农学通报,2011,27(28):47- 52.

[4] 洪义国,孙谧,张云波,等.16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用[J].海洋水产研究,2002,23(1):58- 63.

[5] 梁国栋.最新分子生物学实验技术 [M].北京:科学出版社,2001：2- 3.

[6] 姜莉莉,陈彦闯,辛明秀.枯草芽孢杆菌在防治植物病害上的应用及研究进展[J].安徽农学通报,2009,15(7):37- 39.

[7] 尹汉文,郭世荣,刘伟,等.枯草芽孢杆菌对黄瓜耐盐性的影响[J].南京农业大学学报,2006,29(3)：18- 22.

(责任编辑：张才德)

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：0528- 9017(2017)09- 1600- 02

2017- 07- 12

国家林业局林业公益性行业科研专项(20144119)

何小丽(1983—)，女，工程师，硕士，从事环境生态学研究工作，E- mail:xiaoliheshnu@163.com。

崔心红，E- mail:kysxinhongcui@163.com。

文献著录格式：何小丽，朱义，崔心红. 盐胁迫下沼泽小叶桦土壤细菌数量及种类的变化特征[J].浙江农业科学，2017，58(9)：1600- 1601.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170933