1株Cr（Ⅵ）抗性菌株的筛选鉴定及去除Cr（Ⅵ）特性

张杰　张丽丽　李媛媛

摘要：从东北林业大学林场土壤中筛选分离出1株六价铬[Cr（Ⅵ）]抗性菌株ng 05，经形态、生理生化分析及16S rDNA序列比对研究其分类；同时研究反应温度、溶液pH值以及Cr（Ⅵ）初始质量浓度对该菌去除Cr（Ⅵ）效果的影响，进而确定最佳去除条件；此外，利用傅氏转换红外线光谱分析仪（FTIR）研究菌株去除的机制。结果表明，该菌株为芽孢杆菌属；最佳反应温度为35 ℃，溶液pH值为9，Cr（Ⅵ）初始质量浓度为5 mg/L，在此条件下可以达到很好的去除效果，菌株ng 05对Cr（Ⅵ）的去除效率高达99%以上；对比反应前后的红外光谱图可知，菌体表面的羟基作为电子供体将Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ），氨基、羧基、C—H与Cr（Ⅲ）在菌体表面形成络合物。

关键词：Cr（Ⅵ）；芽孢杆菌；抗性菌株；分离筛选；生物去除；机制研究

中图分类号： X172文献标志码：

文章编号：1002-1302（2017）16-0268-04

[HJ14mm]

收稿日期：2016-11-28

基金项目：国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金（编号：J1210053）；国家自然科学基金（编号：31300573）。

作者简介：张杰（1972—），女，黑龙江哈尔滨人，博士，副教授，主要从事环境微生物方面研究。E-mail：zhangjie1972@nefueducn。

通信作者：张国财，博士，教授，主要从事环境微生物和森林保护方面研究。E-mail：zhang640308@126com。[HJ]

六价铬[Cr（Ⅵ）]主要来源于制革、木材防腐、矿石精炼、金属电镀和色素沉淀等行业，随着工业废水的不断排放，使水体、土壤遭到严重的污染。Cr（Ⅵ）毒性强烈，极易经皮肤、呼吸道、消化道以及黏膜侵入人体，损害肝肾等器官，从而严重危害人的身体健康[3]，而Cr（Ⅲ）毒性约为Cr（Ⅵ）的1%[4-5]。传统上去除Cr（Ⅵ）的方法包括电渗析、化学沉淀、吸附、反渗透以及离子交换等，但这些方法成本较昂贵，且处理过程中会造成二次污染的问题。生物法以处理成本低、操作简单、不易引起二次污染[8]等优点成为去除含Cr（Ⅵ）废水研究的热点之一。瞿建国等筛选出1株抗铬的脱硫弧菌2-S-8，在营养液中加入75 mg/L Cr（Ⅵ），让该菌在其中生长，结果表明，Cr（Ⅵ）的去除率达到100%[9]；朱玲玲等分离得到1株葡萄球菌（Staphylococcus） Y 73，让其生长在Cr（Ⅵ）浓度为1 000 mg/L的培养液中，可以还原83%的Cr（Ⅵ）[10]；Mutter等仔细研究了处于对数增长期的假丝酵母活菌对Cr（Ⅵ）的去除作用，并且研究培养基对Cr（Ⅵ）的去除效果表明，产朊假丝酵母（Candidautilis）对Cr（Ⅵ）的吸附量为7 mg/g，且培养基对Cr（Ⅵ）有还原作用[11-12]。以上研究工作主要偏重于利用培养基中的碳源作电子供体去除Cr（Ⅵ），但在生物去除过程中，培养基中的碳源不仅会造成二次污染，而且具有成本高、用量需严格控制等弊端。目前，关于不添加培养基的纯菌通过自身生理活动直接去除Cr（Ⅵ）的报道较少，因此本研究拟筛选分离出1株Cr（Ⅵ）抗性菌株，在不添加培养基的条件下，考察环境因子对该菌株去除Cr（Ⅵ）效果的影响，并对其机制作进一步分析和探讨，以期为Cr（Ⅵ）生物治理的工业应用提供有益的数据。

1材料与方法

11试验材料

本试验从东北林业大学林场距地面深20 cm处取土壤样品，放入无菌封口袋内，置于4 ℃冰箱内备用。

基础培养基：10 g胰蛋白胨，05 g酵母提取物，10 g氯化钠，100 mL水，调节pH值为70。

12试验方法

121菌株的分离纯化和筛选本试验称取5 g采集的土样，量取5 mL无菌水溶解，搅拌后制成悬浮液。配制好LB培养液，用移液枪吸取1 mL悬液加入150 mL培养液中，用振荡培养箱于150 r/min富集培养18 h后，对菌体进行驯化培养，筛出可以抗铬的菌株。先将菌接种于含5 mg/L重铬酸钾的培养液中，驯化48 h，逐渐提高重铬酸钾的浓度；再将驯化的菌接入含10、15、20、25、30 mg/L重铬酸钾培养液中。然后用接种环蘸取少量菌液，在无菌平板表面进行划线，可在表面得到单菌落，進而获得能在含20 mg/L重铬酸钾培养基上存活的菌株，4 ℃保存。

122菌株形态和生理生化鉴定肉眼观察记录菌落形态，对菌株ng 05进行鉴别染色，利用革兰氏染色法，观测其大小、排列及形态；采用细菌微量生化反应管对菌株进行硝酸盐还原反应、伏普（V-P）反应、甲基红试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、明胶液化、靛基质试验和西蒙氏枸橼酸盐利用[13-14]等生理生化特征的测定。

123菌株16S rDNA序列比对提取菌株ng 05的基因组DNA，利用细菌通用引物27 F、1 492 R进行PCR扩增。扩增反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 100 s，30次循环；4 ℃终止。PCR产物直接进行碱基序列测定。利用NCBI的BLAST进行碱基序列比对，使用MEGA 40软件构建系统进化树。

124菌株去除Cr（Ⅵ）的影响因素使用LB液体培养基对菌株ng 05培养24 h（D600 nm=16～17）后，5 000 r/min离心10 min，菌体用生理盐水洗涤3次，将纯菌接入含 5 mg/L Cr（Ⅵ）模拟废水中，调整各菌体在废水中浓度并使其一致，设置3个重复，振荡培养24 h，每6 h取样3 mL，测定上清液中剩余Cr（Ⅵ）浓度。本试验选择温度、pH值、初始 Cr（Ⅵ） 浓度等因素研究菌体去除Cr（Ⅵ）效果。试验设计如下：pH值5、6、7、8、9、10；反应温度20、25、30、35、40、45 ℃；Cr（Ⅵ） 浓度5、15、25、35、45、55、65 mg/L。

125红外光谱试验（傅氏转换红外线光谱分析仪，简称FTIR）将处理后的菌体制成样品，在红外吸收光谱仪上进行检测并记录其光谱。

13测定方法

Cr（Ⅵ）利用紫外-可见分光光度计，以二苯碳酰二肼分光光度法测定[15]。

2结果与分析

21菌株ng 05鉴定结果

211菌落形态及其生理、生化特征从土壤中筛选出1株Cr（Ⅵ）抗性菌株ng 05，该菌株革兰氏染色后为蓝紫色，为革兰氏阳性菌，菌体大小为（05～25）μm×（12～100）μm，短杆状；在琼脂上，该菌落边沿整齐，表面光滑湿润，易挑取，白色半透明，菌落正反边沿与中央颜色一致（图1）。

由表1可见，菌株ng 05明胶液化试验、伏普（V-P）试验、硝酸盐还原试验和甲基红试验结果呈阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验、靛基质试验及西蒙氏枸橼酸盐利用结果呈阴性。根据以上形态学和生理生化鉴定结果，参照《伯杰氏细菌系统分类学手册》，初步判定菌株ng 05为芽孢杆菌。

注：“+”表示示阳性；“-”表示阴性。

21216S rDNA的序列测定与系统发育分析按照细菌DNA提取试剂盒说明书提取菌株ng 05基因组DNA，进行PCR扩增，获得16 S rDNA序列，长度为1 514 bp，用BLAST将获得的16S rDNA序列和GenBank中的所有序列进行对比，结果显示，菌株ng 05与芽孢杆菌属相似度高达99%以上，并且经MEGA 40软件构建16S rDNA的系统发育树（图2）进一步分析。根据形态学、生理生化特征结果以及16S rDNA序列比对结果综合分析，最终将菌株ng 05鉴定为芽孢杆菌属。

22反应温度对Cr（Ⅵ）去除的影响

从图3可以看出，在20～35 ℃下，菌株ng 05对Cr（Ⅵ）均有不同程度的去除，随着温度的升高，去除效率也会逐渐增大，温度为35 ℃的条件下效果最佳，去除率可以达到99%以上，而超过35 ℃后Cr（Ⅵ）去除效率就逐渐下降。因此可知，35 ℃是去除Cr（Ⅵ）的最佳温度。

由于微生物去除Cr（Ⅵ）的过程是酶促反应，在过低的温度下细胞膜流动性的减弱能够阻碍运输系统的正常运行，使基质不能顺利进入胞内供给细菌而满足其正常生长的需求；在过高的温度下，蛋白质会发生变性，而且是不可逆的，进而使去除Cr（Ⅵ）的蛋白酶功能受到损伤，改变细胞膜的结构或影响蛋白合成机制[16]，由此说明，此菌株在温度35 ℃时酶促反应最佳。

23pH值对Cr（Ⅵ）的去除效果影响

本试验在pH值5、6、7、8、9、10的范围内研究菌株ng 05对Cr（Ⅵ）去除的影响。从图4可以看出，pH值越高，Cr（Ⅵ）的去除效率也更佳，当pH值为9时，Cr（Ⅵ）去除率最大，达到99%以上，随后pH值继续升高，去除效率则下降。

菌株ng 05去除Cr（Ⅵ）是质子消耗过程，因此Cr（Ⅵ）去除效率随着pH值升高而提高；同时，菌株ng 05去除Cr（Ⅵ）也是酶促反应过程，过高的pH值会对蛋白酶的电离率造成影响，使蛋白酶的功能受损，从而影响其活性。因此，选择合适的pH值对菌株去除Cr（Ⅵ）至关重要。由本试验可知，在pH值为9时，菌株ng 05蛋白酶活性最强，Cr（Ⅵ）去除率也最高。

24不同初始Cr（Ⅵ）浓度对菌株ng 05去除Cr（Ⅵ）的影响

从图5可知，Cr（Ⅵ）浓度为5 mg/L时的去除效果最佳，去除效率达99%以上；但随着Cr（Ⅵ）浓度的升高，去除效率也随之下降。

由于菌株去除Cr（Ⅵ）是酶促反应过程，Cr（Ⅵ）浓度的升高，使细胞表面上的活性位点与铬离子碰撞的机会增大，Cr（Ⅵ） 需求的活性结合位点很多，进而增强了蛋白酶的催化效率，直到满足限制浓度，达到饱和状态。一旦Cr（Ⅵ）浓度高于限制浓度，菌株去除Cr（Ⅵ）效率就会随着金属离子浓度的增大而降低，所以Cr（Ⅵ）浓度为5 mg/L時的去除效果最佳。

25红外光谱分析（FTIR）

由图6可见，ng05菌株细胞表面存在多种官能团：3 38675 cm-1 处的吸收峰是羟基，2 92645 cm-1处的是 —CH3、—CH2的对称和反对称的变形伸缩振动吸收带，1 65381 cm-1 处的可能是羧基基团中的羰基峰，或者是羰基、氨基的共轭峰；1 40013 cm-1处的吸收峰为—CH3与 —CH2 的弯曲振动；1 06769 cm-1处的吸收峰可能是多糖或多糖类似物的C—O键和硅酸盐杂质的Si—O键伸缩振动峰[17]。对比Cr（Ⅵ）处理前后的FTIR谱，3 38675 cm-1处的羟基吸收峰，加入Cr（Ⅵ）后从3 38675 cm-1处发生位移至 3 29957 cm-1，吸收峰相对反应前均有很大减弱。

对于微生物去除Cr（Ⅵ），大部分学者认为是胞外还原作用。Chatterjee等认为，细胞壁表面的—OH与—NH参与 Cr（Ⅵ） 的还原[18]。而Kang等则认为，可以通过细胞表面的—C[FY=，1]O形式吸附Cr（Ⅵ）[19]。在本研究中，结合Cr（Ⅵ）处[CM（25]理前后菌体的FTIR谱图分析结果显示，吸收峰相对反应[CM）]

前均有很大减弱，说明菌体与Cr（Ⅵ）反应后表面的羟基数量减少，可能是由于羟基作为电子供体，参与了氧化还原反应[20]，被还原而得的Cr（Ⅲ）主要形成氢氧化物沉淀或者Cr（Ⅲ）与羧基、羰基形成络合物[21]存在于菌体表面。

3结论

从东北林业大学林场土壤中筛选分离出1株Cr（Ⅵ）抗性菌株ng 05，对其进行形态学鉴定、生理生化分析以及16S rDNA序列比对鉴定表明，菌株ng 05为芽孢杆菌属。

不添加培养基的纯菌去除Cr（Ⅵ）的效果在35 ℃、pH值为9、初始Cr（Ⅵ）浓度为5 mg/L的条件下效果最佳，去除率达99%以上。

采用FTIR方法分析可知，在反应前后，菌体表面上的羟基作为电子供体将Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ），氨基、羧基、C—H与Cr（Ⅲ）在表面形成络合物，研究结果可为Cr（Ⅵ）去除机制提供基础理论依据。

参考文献：

Narayani M，Shetty K VChromium-resistant bacteria and their environmental condition for hexavalent chromium removal：a review[J] Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2013，43（9）：955-1009

周宜开 环境流行病学基础与实践[M] 北京：人民卫生出版社，2013：249-252

[3]周梦芝，王华锋，郑月慧，等 常见重金属污染与男（雄）性不育[J] 中国公共卫生，2013，29（5）：769-772

[4]Xu Y，Zhao D Reductive immobilization of chromate in water and soil using stabilized iron nanoparticles[J] Water Research，2007，41（10）：2101-2108

[5]Petruzzelli D，Passino R，Tiravanti G Ion exchange process for chromium removal and recovery from tannery wastes[J] Water Science & Technology，1995，36（2/3）：197-207

[6]Camargo F A O，Okeke B C，Bento F M，et al Diversity of chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate[J] Applied Soil Ecology，2005，29（2）：193-202

[7]Barbooti M M，Ageena N A，Tooma M A Removal of chromium from electroplating wastewater by simple chemical treatment and ion exchange[J] Eng Technol，2008，26：11-13

[8]申如香，瞿建国，张晓旗，等 微生物法处理冷轧含铬（Ⅵ）废水的实验研究[J] 上海化工，2001（1）：4-6[HJ174mm]

[9]瞿建国，申如香，徐伯兴，等 硫酸盐还原菌还原Cr（Ⅵ）的初步研究[J] 华东师范大学报（自然科学版），2005（1）：105-112

[10]朱玲玲，曹佳妮，张文，等 一株耐铬细菌的鉴定及其还原铬性能分析[J] 环境科学学报，2013，33（10）：2717-2723

[11]Mutter O，Patmalnieks A，Rapoport A Interrelations of the yeast Candida utilis and Cr（Ⅵ）：metal reduction and its distribution in the cell and medium[J] Process Biochemistry，2001，36（10）：963-970

[12]Muter O，Lubinya I，Millers D，et al Cr（Ⅵ） sorption by intact and dehydrated Candida utilis cells in the presence of other metals[J] Process Biochemistry，2002，38（1）：123-131

[13]布坎南R E，吉布斯E N 伯杰氏细菌鉴定手册[M] 8版 颜子颖，王海林，译 北京：科学出版社，1999：498-501

[14]Gibbons N E伯杰氏细菌鉴定手册[M] 北京：科学出版社，1984：482-484

[15]苏文海 二苯碳酰二肼分光光度法测定六价铬方法的改进[J] 环境科学导刊，2009，28（5）：77-79

[16]Narayani M，Shetty K V Chromium-resistant bacteria and their environmental condition for hexavalent chromium removal：a review[J] Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2013，43（9）：955-1009[HJ176mm]

[17]宋東涛，李吉进，聂俊华，等 膨润土对土壤腐殖质特性的影响[J] 生态环境学报，2008，17（2）：722-726

[18]Chatterjee S，Ghosh I，Mukherjea K K Uptake and removal of toxic Cr（Ⅵ） by Pseudomonas aeruginosa：physic-chemical and biological evaluation[J] Current Science，2011，101（5）：645-652

[19]Kang S Y，Lee J U，Kim K W Biosorption of Cr（Ⅲ） and Cr（Ⅵ） onto the cell surface of Pseudomonas aeruginosa[J] Biochemical Engineering Journal，2007，36（1）：54-58

[20]Krishnani K K，Meng X G，Christodoulatos C Biosorption mechanism of nine different heavy metals onto biomatrix from rice husk[J] Journal of Hazardous Materials，2008，153（3）：1222-1234

[21]Shen Y S，Wang S L，Huang S T，et al Biosorption of Cr（Ⅵ） by coconut coir：spectroscopic investigation on the reaction mechanism of Cr（Ⅵ） with lignocellulosic material[J] Journal of Hazardous Materials，2010，179（1/2/3）：160-165