高效木质素降解菌株的分离筛选与鉴定

常燕　卢晓凤　王兆慧

摘要：为提高农作物秸秆中木质素的降解速度，从腐烂的树枝和土壤中筛选出一株高效降解木质素的菌株。结果表明，该菌株18S rDNA序列与二年残孔菌（Abortiporus biennis）有高度的同源性，结合其形态特征，初步鉴定该菌株为二年残孔菌，命名为H。

关键词：木质素；同源性；二年残孔菌（Abortiporus biennis）

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3431-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.010

Abstract： In order to increase crop stalk degradation， one strain of ligninase-producing epiphyte was selected from rotten plants and soil. The results showed that 18S rDNA sequence showed high homology with Abortiporus biennis， and in combination withmorphologic character，the strian was determined as A. biennis，named as H.

Key words： lignin； homology； Abortiporus biennis

农作物秸秆是农业生产中产生的一种重要的可再生性能源[1]，传统的方法将其进行焚烧或废弃，不仅浪费了资源还污染了环境。如果将农作物秸秆先通过微生物的作用腐熟再还田，不仅可以改良土壤结构，使土壤物理性状更加趋于合理化[2-4]，还可以丰富土壤中微生物种群的数量和结构[5-7]，使农作物秸秆还田的意义更重大，也是目前利用秸秆资源最合理、最有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 样品采集于南通大学主校区北侧朽木众多、空气潮湿、树林茂密且长年无人进入的地表下2～5 cm的土壤。

1.1.2 培养基与试剂盒 富集培养基：硫酸铵2.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸二氢钾1.0 g、氯化钠0.5 g、木质素20 g、定容至1 000 mL，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。

PDA培养基：取马铃薯200 g，去皮，切成小块煮沸30 min，接着用纱布过滤，取滤液，加入蔗糖20 g、琼脂20 g，待融化后补水至1 000 mL，自然pH，121 ℃高压蒸气灭菌15 min[8]。

GU-PDA固体培养基：于PDA培养基中加入愈创木酚，使其浓度为0.1%[9]。

真菌DNA基因组抽提试剂盒（上海生物工程有限公司）。

1.1.3 仪器 电子天平、摇床、冰箱、超净工作台、恒温培养箱、红外炉、高压蒸气灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、显微镜、离心机、电泳槽、PCR仪等。

1.2 方法

1.2.1 可降解木质素菌株的富集 用电子天平称取土壤样品2 g，加入到装有200 mL的富集培养基中，于28 ℃振荡培养7 d。

1.2.2 可降解木质素菌株的复筛 取1 mL上述富集培养液，通过梯度稀释法将其稀释成10-3、10-4、10-5、10-6不同的浓度，分别涂布在GU-PDA固体培养基上，倒置于28 ℃的隔水式恒温培养箱内培养3～5 d。

1.2.3 菌株的纯化与保藏 将上述复筛培养基上显色圈最大的作为目的菌株，命名为H。通过划线法进行纯化，将纯化的目的菌株制成孢子悬液，加入适当甘油，置于与-70 ℃超低温冰箱保藏。

1.2.4 菌株的鉴定

1）菌株形态观察。以点接法将目的菌株的孢子接种在PDA平板上，30 ℃培养5 d观察其菌落的形态；菌絲体的观察则采用插片法进行观察[10]。

2）分子鉴定。①菌株基因组的提取。将目的菌株接种于装有50 mL PDA培养液的250 mL锥形瓶中，160 r/min 30 ℃摇床培养5 d；用无菌纱布过滤后，转移到冰冻的无菌研钵中进行研磨破壁；用真菌DNA基因组抽提试剂盒提取该菌株的DNA。②提取基因组的PCR扩增。扩增采用25 μL体系，其中模板2 μL、Buffer 2.5 μL、上引物ITS1 1 μL、下引物ITS3 1 μL、dNTPs 2 μL、ddH2O 16.4 μL，最后加入Taq酶0.1 μL；PCR条件：95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环。③PCR产物的测序。将PCR扩增后的产物送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行PCR产物测序。④18S rDNA基因序列同源性分析及系统发育树的构建。通过NCBI的BLAST检索系统，对所筛选菌株的18S rDNA基因序列进行同源性分析，从结果中获取相似的11种多孔菌菌株18S rDNA基因序列，利用Mega 4软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

图1为所筛菌株H在GU-PDA固体培养基上培养5 d后的菌落形态。由图1可以看出，该菌在鉴定培养基上有很大的显色圈，表明该菌能代谢较高的木质素酶。菌落较疏松，菌丝乳白色。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的菌丝形态 插片培养5 d后，在40倍显微镜下观察菌株H菌丝的形态，无色透明，壁薄，有简单的隔膜（图2）。

2.2.2 菌株的鉴定 以菌株基因组DNA为模板，PCR扩增18S rDNA片段，测序结果显示克隆片段长1 716 bp。将其基因序列用BLAST进行同源性比对，依据同源性检索结果，选取不同多孔菌种属的代表菌株构建系统发育树，其与二年残孔菌（Abortiporus biennis）18S rDNA基因序列相似性为100%（图3）。因而，从分子水平上进一步证实分离菌株H为二年残孔菌。endprint

3 讨论

二年残孔菌属属于真菌界担子菌门多孔菌科，分布于世界各地。本菌属的菌多数具有较高的纤维素酶和木质素酶降解能力[11]，且该菌常出现在许多种类的阔叶树上或地下埋有腐木的地上，是一种能引起木质腐朽的真菌，这与本试验的筛菌目的相吻合。此菌株可以作为后续进行秸秆的复合降解以及与木质素降解相关的实际应用的研究。

参考文献：

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[2] 王德科，吴红燕，黄 剑，等.秸秆还田对土壤理化性状及小麦生长的影响[J]，现代农业科技，2013（15）：243，245.

[3] 刘义国，刘永红，刘洪军，等.秸秆还田量对土壤理化性状及小麦产量的影响[J].中国农学通报，2013，29（3）：131-135.

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[5] 崔俊涛，窦 森，张 伟，等.玉米秸秆对土壤微生物性质的影响[J].吉林农业大学学报，2005，27（4）：424-428.

[6] 王志明，朱培立，黄东迈，等.秸秆碳的田间原位分解和微生物量碳的周转特征[J].土壤学报，2003，40（3）：446-453.

[7] 刘建国，卞新民，李彦斌，等.长期连作和秸秆还田对棉田土壤生物活性的影响[J].应用生态学报，2008，19（5）：1027-1032.

[8] 沈 萍，陈向东.微生物学实验[M].第4版.北京：高等教育出版社，2007.

[9] KIRK T K，CROAN S，TIEN M，et al. Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium：Effect of selected growthconditions and use of a mutantstrain[J].Enzyme and Microbial Technology，1986，8（1）：27-32.

[10] 蔡信之.插片法觀察放线菌霉菌效果好[J].实验教学与仪器，1995（2）：28.

[11] 赵继鼎.中国真菌志（多孔菌科）[M].第3卷.北京：科学出版社，1998.endprint