百草枯对小鼠肝脏的损伤研究

鲁豫

摘要：為了解百草枯对哺乳动物肝脏损伤的特性，以便有效寻找针对性治疗药物，试验建立了小鼠模型，分别向昆明白雄鼠腹腔注射30、60、90 mg/kg不同浓度的百草枯，各处理分别于6、12 h以及1、3、7 d后测定血清中的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性，对百草枯染毒的各浓度处理小鼠肝脏进行苏木精-伊红染色，观察其病理学变化，然后选取中剂量60 mg/kg处理的不同时间组（6、12 h以及1、3、7 d），通过Realtime PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Caspase-8基因表达变化。结果表明，百草枯30、60、90 mg/kg不同浓度处理的血清ALT、AST活性在不同处理时间上均高于对照，在7 d后各血清ALT、AST活性均又呈现下降趋势。染色结果发现在处理3 d后的30 mg/kg的小鼠肝脏病理学变化不明显，90 mg/kg处理出现较为明显的炎症变化。Realtime PCR结果显示，60 mg/kg不同时间处理的IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Caspase-8基因表达从6 h后开始呈现上升趋势，在3 d后基因表达略有下降。不同浓度的百草枯对小鼠肝脏均有损伤，高剂量百草枯对肝脏损伤较严重，且对血清中免疫因子和相关基因的表达有显著影响。

关键词：百草枯；小鼠；肝脏损伤；基因表达

中图分类号：S482.4：R994.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3515-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.031

Abstract： In order to study the liver damage characteristics of Paraquat in mammals. This experiment by establishing mice model were studied. Respectively to the male mice celiac injection of different concentration of Paraquat（30，60，90 mg/kg）， the experimental group were determined in the serum ALT and AST activity on 6 h，12 h，1 d，3 d and 7 d. Observe the patholodical changes of mice liver tissue was contaminated by various concentrations PQ after three days，then select 60 mg/kg dose group concentration in treatment group at different times（6 h，12 h，1 d，3 d，7 d）. We detected the expression of IL-1β，IL-6，TNF-α，Caspase-3，Caspase-8 by Realtime PCR. Different concentrations of experimental group serum ALT， AST activity in different time were significantly higher than the control group， the activity were lower after 7 days. The coloration results showed that liver histopathological changes （30 mg/kg） is not significant on 3 days， and the 90 mg/kg experimental group was changed significantly. Realtime PCR results showed that the related gene（60 mg/kg） expression began to rise after 6 hours，and the gene expression declined after 3 days. All the liver damage was serious， high dose concentration of Paraquat on liver tissue damage more serious. Different doses of Paraquat on serum immune factors and has remarkable effect on the expression of related genes.

Key words： Paraquat； mice； liver injury； gene expression

百草枯（Paraquat，PQ）又名克无踪，化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是世界各国农作物常用的除草剂，具有较强的毒性，尤其对人的毒性极大，是一种潜在的环境危险因素，因此要重视百草枯的残留问题。有报道称百草枯中毒表现为早期的肺水肿、肺出血及肺不张等急性肺损伤症状，后期多死于呼吸衰竭[1]。沈明浩等[2]发现妊娠末期大鼠注射百草枯会引起胎鼠动脉管的收缩。夏勇等[3]发现百草枯导致斑马鱼各项指标变化，延缓斑马鱼胚胎发育，造成胚胎致死或畸型。百草枯摄入后能分布于机体的各组织器官，但主要聚集在肺、肾、肝等器官中，会导致其氧化损伤与纤维化病变[4]。百草枯中毒后在体内主要作用于肺组织，重度中毒患者常出现急性肝功能障碍[5]。肝脏是机体代谢的重要器官，肝组织细胞一旦受损伤，将影响机体的代谢平衡。试验通过设置不同剂量的百草枯及染毒的不同时间处理，观察肝组织的病理学变化、血液生化反应以及相关基因分子水平上的变化、不同剂量的百草枯及染毒的不同时间对小鼠肝脏的损伤情况，以便有针对性地寻找有效的治疗性药物。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用百草枯购于美国Sigma公司，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）测试盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 试验动物

采用清洁级昆明种系的21 dpp雄性小鼠为参试动物，体重范围在14～16 g，购自菏泽医学专科学校。按随机法将小鼠分为4组：对照组常规饲养，不给予任何处理；染毒组分别腹腔注射浓度为30、60、90 mg/kg的百草枯。每个染毒组再分为3个亚组，每个亚组5只，分别染毒6 h、12 h、1 d、3 d、7 d后处死，采集血液及组织标本。

1.3 肝组织病理学观察

取各组梁毒3 d小鼠的肝组织，一部分组织放入液氮中冻存，用于提取RNA，另外一部分组织置于4%的多聚甲醛中固定，然后进行梯度乙醇脱水（30%、40 min，50%、40 min，70%、1 h，83%、1 h，95%、40 min，无水乙醇、30 min，无水乙醇、20 min），接着在二甲苯中透明，再将浸好蜡的组织进行包埋，切片，烤片。然后进行二甲苯脱蜡和梯度乙醇复水，再用苏木精-伊红染液进行HE染色。通过镜检，观察肝组织的病理学变化。

1.4 血液生化指标检测

检测血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶，将小鼠通过摘眼球取血液1 mL，离心分离血清，采用全自动生化分析仪检测，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 肝组织基因表达变化检测

选取60 mg/kg百草枯的5个不同时间处理，通过Realtime PCR检测5种基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3和Caspase-8）表达的变化，首先提取小鼠肝组织的RNA，然后反转录合成单链的cDNA，将反转录产物cDNA按照TaKaRa SYBR Premix EX Taq试剂盒说明书在ABI7500 Realtime PCR系统中反应，基因特异性引物序列见表1，以GAPDH作为内参（对照）。

1.6 统计学方法

所有处理都3次重复，取均值，最终数据采用“平均值±标准误”表述。对多于2个处理的数据用单因素方差分析，2个处理用t检验统计分析。

2 结果与分析

2.1 中毒表征

观察发现，百草枯染毒后，对照组小鼠精神表现正常，食欲正常，呼吸均匀，体重没有减轻；百草枯30 mg/kg剂量组在染毒1 d后出现轻微的食欲不振等现象，无其他明显症状，在6～7 d时食欲逐渐恢复；百草枯60 mg/kg剂量组在染毒1 d后表现出较明显的中毒症状，进食少，体重下降，嗜睡；百草枯90 mg/kg剂量组在染毒6 h后就表现出较明显的中毒症状，步态不稳，烦躁，在3 d后症状更明显，表现为呼吸急促、进食少、反应迟钝、嗜睡、体重下降、易捕捉等症状。

2.2 小鼠肝组织病理学变化

百草枯染毒后小鼠肝组织病理学检测结果见图1。从图1可知，对照组肝组织结构正常，肝细胞形态正常并且整齐排列，肝组织血管形态、结构正常；百草枯30 mg/kg剂量组在3 d后肝组织细胞排列紧密，但肝细胞略微肿胀；百草枯60 mg/kg剂量组在3 d后肝细胞略有肿胀，肝血窦和中央静脉周围开始有轻微淤血；百草枯90 mg/kg剂量组在3 d后肝组织细胞排列稍显松散，肝细胞肿胀明显，肝血窦和中央静脉周围出现淤血，肝血窦萎缩，炎性细胞浸润。

2.3 小鼠血清中的ALT、AST水平比较

小鼠血清中ALT和AST水平常作为肝细胞损伤程度的重要指标，试验里百草枯染毒后，小鼠血清中ALT、AST活性测定结果分别见表2、表3。从表2可见，百草枯90 mg/kg剂量组的ALT活性最高，在处理12 h、1 d、3 d后均显著高于对照（P<0.05），在 7 d后不同百草枯浓度处理的ALT活性都略有降低。从表3可见，百草枯90 mg/kg处理的AST活性在处理6 h、12 h、1 d、3 d后均显著高于对照（P<0.05），不同处理均在1 d后的AST活性最高，在3 d后和7 d后的AST活性略有降低。

2.4 小鼠肝組织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3和Caspase-8基因表达变化

IL-1β、IL-6、TNF-α是肝组织中相关炎性表达基因，Caspase-3和Caspase-8是执行细胞凋亡的关键基因。试验选取中剂量60 mg/kg百草枯的不同时间进行处理，分别是6 h、12 h、1 d、3 d、7 d。通过Realtime PCR检测IL-1β等的mRNA水平在处理后的变化，结果见图2。从图2可见，60 mg/kg百草枯处理6 h后，IL-1β表达水平明显高于对照，在1 d时表达水平显著高于对照（P<0.05）；IL-6的表达水平也是在1 d后显著高于对照（P<0.05）。同时检测TNF-α的表达水平在1 d后达到最高，在3 d后表达水平开始下降。Caspase-3基因表达在处理1 d、 3 d后显著高于对照（P<0.05），之后又呈现下降趋势；Caspase-8的表达则是在1 d后显著高于对照（P<0.05），3 d后开始下降。

3 小结

百草枯是一种强有机氧化剂，农业上多用作除草剂使用，一旦被误食进入人体内，会经过一系列氧化还原反应形成高活性自由基，进而诱导过氧化反应，损伤体内脏器[6]。有报道发现百草枯中毒病人其肺部蓄积量最多，进而会影响机体呼吸系统导致呼吸衰竭[7]。此外，肾脏作为主要的代谢器官，高剂量的百草枯同样会对肾脏造成严重损伤[8]。肝脏是哺乳动物体内最重要的排毒代谢器官，高活性自由基的蓄积不仅会损伤肝组织，还会影响肝脏正常的代谢功能[9]。百草枯对机体的损伤研究较多的器官是肺脏，也有研究发现百草枯同样会损伤肝脏。试验在此研究基础上，深入研究了百草枯对小鼠肝脏的损伤特点。结果表明，百草枯对小鼠肝脏造成损伤后出现炎症反应，这其中，血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫因子表达基因发挥着重要的作用；百草枯进入机体后，会通过多个途径诱导这些免疫因子的基因表达，其中TNF-α发挥着关键作用，它可以将中性粒细胞引进肝细胞内，并诱导肝库浦弗细胞释放氧自由基，同时加重肝脏微循环障碍，使肝组织出现缺血缺氧性损伤[10-12]。另外，TNF-α在机体内产生后还会诱导IL-1β的生成。endprint

Caspase是存在于细胞质中的一组结构类似的蛋白酶，在细胞凋亡途径中发挥着关键作用，起始Caspase和执行Caspase共同组成细胞内凋亡信号的级联分子网络。Caspase-8在复合物中通过自身切割而被激活，进而切割执行者Caspase-3，产生有活性的Caspase-3，从而导致细胞凋亡[13]。

试验通过对不同浓度百草枯处理3 d后的小鼠肝脏组织进行苏木精-伊红染色，发现90 mg/kg剂量组在处理3 d后的肝组织中细胞排列稍显松散，肝血窦和中央静脉周围出现淤血，肝血窦萎缩，炎性细胞浸润。通过测量小鼠血清中ALT和AST的活性，发现在处理12 h、1 d、3 d后ALT均显著高于对照，7 d后不同浓度处理中ALT活性开始下降；同时90 mg/kg处理的AST活性在6 h、12 h、1 d、3 d后均显著高于对照。通过Realtime PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平，均在1 d后达到最高；Caspase-3和Caspase-8分别是在处理3 d后和1 d后表达最高。说明不同剂量的百草枯对血清中免疫因子以及细胞凋亡相关基因的表达均产生显著影响。

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