反相高效液相色谱法测定30%二氯吡啶酸水剂的方法研究

刘骞　程运斌　张杰

摘要：建立了一种反相高效液相色谱法测定30%二氯吡啶酸水剂含量的方法。试样用流动相溶解，采用等度洗脱的方法，以甲醇-醋酸铵-氨水为流动相，普通C18为色谱分析柱，对二氯吡啶酸进行分离，外标法定量。结果表明，该方法的线性相关系数为0.999 6，变异系数为0.522%，平均回收率为100.3%。色谱图峰形好，出峰时间短，对色谱柱要求低，满足农药产品含量分析的要求。

关键词：二氯吡啶酸；等度洗脱；反相高效液相色谱

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3534-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.036

Abstract： A RP-HPLC method was established for detection of clopyralid 30% AS. The sample was dissolved with mobile phase and analyzed by RP-HPLC using the mixture of methanol and ammonium acetate and ammonia as the mobile phase and ordinary C18 as chromatographic column in isocratic elution method. In addition， the quantificaation was calculated by external standard method. The linear correlation coefficient for clopyralid was 0.999 6，the variation coefficent was 0.552%， and the average recovery was 100.3%. Under the chromatographic conditions in this paper， the peak shape of dicloxypyridine acid is good， the retained time is short and low requires on the column. The method has met the requirements of analysis of pesticide products.

Key words： clopyralid； isocratic elution； RP-HPLC

二氯吡啶酸（Clopyralid）是一種化学合成的激素类除草剂，化学名称为3，6-二氯吡啶-2-羧酸，商品名龙拳、毕草克等，由美国陶氏公司研制。杀死杂草途径有两种，一种是由植物茎叶吸收，破坏植物体内激素平衡，导致杂草死亡，另一种是由韧皮部传导至根，杀死深根类杂草。主要用于防治油菜、玉米、小麦田、草坪等田间的一年生阔叶杂草和深根多年生阔叶杂草（菊科和豆科杂草），其中对大刺儿菜、苦苣菜、藏蓟等阔叶难防杂草效果较好[1-6]。

目前，有关这种农药分析的液相色谱法报道很多，但都采用酸性流动相体系作为检测条件，在该条件下分离检测二氯吡啶酸对分析所用的色谱柱要求高，需要高水平的硅醇基封尾的色谱柱才能获得保留时间合适且对称性好的窄峰[7-10]。建立一种简便的高效液相色谱法，仅使用普通的C18色谱柱就可以在合适的分析时间内得到对称性好的窄峰的分析方法是非常有必要。因此，本研究采用甲醇-醋酸铵-氨水作为流动相，建立了反相高效液相色谱法测定30%二氯吡啶酸水剂中二氯吡啶酸的含量。该方法仅使用普通的C18色谱柱就可在5 min内完成分离工作，而且精密度高、准确度好、线性关系良好，可为企业产品质量控制和检测机构质量检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-10AD型高效液相色谱仪，配备SPD-10AVP型紫外检测器（日本SHIMADZU公司）；色谱柱为Inertsil？誖ODS-3 250 mm×4.6 mm，5 μm（日本SHIMADZU-GL公司）；XP504R型电子天平（瑞士Mettle Toledo公司）；SONOREX型超声波清洗器（德国Bandelin公司）；Milli-Q型超纯水仪器（美国 Millipore公司）；有机系尼龙过滤头，滤膜孔径约为0.22 μm（天津津腾公司）。甲醇、醋酸铵（色谱纯，美国J.T.Baker公司）；氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

试验用水为超纯水，二氯吡啶酸（98.1%，上海市农药研究所有限公司）；30%二氯吡啶酸水剂（由某企业提供）。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱条件 流动相为甲醇-醋酸铵-氨水溶液（体积比30∶70，醋酸铵溶液用氨水调pH至8.0），流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为280 nm，进样体积为20 μL，二氯吡啶酸的保留时间约为4.3 min。二氯吡啶酸的标样液相色谱见图1，典型质量分数为30%二氯吡啶酸水剂样品液相色谱见图2。

1.2.2 标样的制备 称取0.05 g（精确至0.000 1 g）二氯吡啶酸标样于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀作为母液备用。取2 mL母液于25 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀作为检测样品的标样溶液使用。

1.2.3 试样溶液的制备 称取0.200 0 g质量分数为30%二氯吡啶酸水剂样品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解超声15 min后再稀释至刻度，取上述样品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀后用0.22 μm微孔滤膜过滤后检测其二氯吡啶酸的含量。endprint

1.2.4 二氯吡啶酸质量分数的测定 待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针二氯吡啶酸的峰面积相对变化小于1.5%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中二氯吡啶酸的峰面积分别进行平均。试样中二氯吡啶酸的质量分数按式（1）计算。

式中，A1为标样溶液中二氯吡啶酸面积的平均值，A2为试样溶液中二氯吡啶酸峰面积的平均值，m1为二氯吡啶酸标样的称样量（g），m2为试样的称样量（g），V1为标样的定容体积（mL），V2为试样的定容体积（mL），P为标样中二氯吡啶酸的质量分数（%）。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择 通过LC-10AD型高效液相色谱仪的光谱扫描功能，获得二氯吡啶酸的紫外波长光谱图（图3）。从图3可以看到，二氯吡啶酸在277.73 nm处有最大吸收波长，故选择280 nm为检测波长。

2.1.2 流动相的选择 二氯吡啶酸的检测多采用反向液相色谱法，其检测条件为酸性流动相体系，本研究也利用了该方法检测了二氯吡啶酸，但二氯吡啶酸的峰形不佳，存在峰拖尾、峰展宽以及峰不对称的问题，且分析时间较长，不便用于实际的检测工作中（图4a、4b、4c）。可能是因为二氯吡啶酸的分子结构中的吡啶环与色谱柱填料中的硅羟基的相互作用，导致峰拖尾和保留时间增大。因此，本研究采用甲醇-醋酸铵-氨水（甲醇∶醋酸铵=30∶70，醋酸铵溶液浓度为87.5 mmol/L，pH 8.0）流动相体系，得到对称的窄峰（图4d），且分析时间短，可用于实际的检测分析。

进一步验证是否是二氯吡啶酸的分子结构中的吡啶环与色谱柱填料中的硅羟基的相互作用而导致峰拖尾，选用了资生堂的C18 MGⅡ的色谱柱为分析柱，该柱子的硅醇基被高水平封尾适用于困难的碱性化合物的分析，在酸性流动相体系下分离检测二氯吡啶酸，得到的峰形尚可，保留时间较短（图4e），也可用于实际的检测分析。说明之前峰拖尾的原因是因为二氯吡啶酸的分子结构中的吡啶环与色谱柱填料中的硅羟基的相互作用。

综上所述，在酸性流动相体系下分离检测二氯吡啶酸，要获得好的峰形和合适的保留时间，需要使用特殊的色谱柱，而在本研究建立的色谱方法中不需要特殊的色谱柱，仅需改变流动相的组成就可以获得优于使用特殊的色谱柱时的峰形和合适的保留时间，在实际应用中更为便捷。

2.2 线性相关性试验

将标样溶液在上述色谱条件下进行分析，进样量分别为12、14、16、18、20、22、24 μL，以质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，二氯吡啶酸的线性相关曲线为y=45 931.4x+5 569.60，R2=0.999 6，可满足定量分析的要求。

2.3 精密度试验

从同一产品中准确称取5份试样，在上述色谱条件下进行分析，测得二氯吡啶酸的平均含量为28.3%，变异系数为0.522%（表1），表明该方法具有较高的精密度。

2.4 回收率试验

称取5个已知含量的质量分数为30%二氯吡啶酸水剂样品，分别加入一定量的二氯吡啶酸标样（质量分数为98.2%），在上述色谱条件下分析测定二氯吡啶酸的加标回收率，测得二氯吡啶酸的回收率在99.6%～101.1%，平均回收率为100.3%（表2），表明该方法具有较好的准确度。

3 小结

利用反相高效液相色谱法测定农药产品中的二氯吡啶酸的含量。该方法操作简便，分析时间短，对色谱柱的要求不高，而且具有良好的线性相关性、高精密度和准确度，实用性高，可为农药产品企业制定企业标准提供参考。

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