可视化猪肺炎支原体LAMP检测方法的建立

熊 炜，王 艳，魏晓锋，李春阳，张 强，黄忠荣，胡建华，李 健

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.上海实验动物研究中心，上海 201203）

可视化猪肺炎支原体LAMP检测方法的建立

熊 炜1，王 艳1，魏晓锋2，李春阳1，张 强1，黄忠荣1，胡建华2，李 健1

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.上海实验动物研究中心，上海 201203）

由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）引起的慢性肺炎是最难净化的疫病之一，它流行广、感染率高，对养猪业危害巨大。为了加强口岸现场查验动物源性产品中猪肺炎支原体的力度，本研究建立了猪肺炎支原体环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）检测方法。本研究通过在LAMP反应产物中加入显色液，提高了检测结果肉眼判定的准确性，实现了结果判定可视化的目标，有助于出入境口岸货物查验现场及猪场中猪肺炎支原体的检测。

猪肺炎支原体；LAMP；可视化检测

Abstract:Mycoplasma hyopneumoniae causes chronic pneumonia among pigs, which is one of hard erased diseases with characters of wide spread and high infection. In order to survey and detect Mycoplasma hyopneumoniae carried by animal original products at entryexit port, a Loop-mediated isothermal ampli fi cation (LAMP) method was established and proved to be speci fi c with high sensitivity and stability. By adding SybrGreen into LAMP product liquid, detection results could be read easily by eyes, which is more convenient to be used by ports and basic laboratories.

Key words:Mycoplasma hyopneumoniae；loop-mediated isothermal ampli fi cation (LAMP)；visible detection

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎，长期以来，本病一直被认为对养猪业造成重大经济损失、且最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一[1,2]。猪肺炎支原体对生长条件的需求极为苛刻，体外分离培养相当困难，它在传统的基本肉汤培养基中生长缓慢，需经3～30 d，肉汤培养基才能产生轻微的混浊，并产酸使颜色发生变化[3,4]。因此，传统的生化和血清学检测方法应用于进出境口岸猪肺炎支原体快速检测具有明显的局限性。此外，由于猪肺炎支原体易与其他猪病病原体相混淆，自然发生的病例均为混合感染，其可能混杂有细菌、病毒和寄生虫，因此其对检测方法的特异性、敏感性要求较高[5]。环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸检测方法，其特异性和敏感性可以与荧光PCR媲美，同时其检测周期短、操作简便、对检测硬件设备的要求较低，适合于野外现场使用。目前，该技术已成功应用于口蹄疫、猪瘟等重大动物疫病的检测，但应用于猪肺炎支原体的检测鲜有报道。本研究通过分析猪肺炎支原体的基因序列，设计了多套LAMP引物体系，从中筛选出了理想的引物，建立了猪肺炎支原体的LAMP检测方法，并实现了检测结果的可视化判读。

1 材料与方法

1.1 主要试剂ThermoPol缓冲液、Bst DNA聚合酶购自New England BioLabs公司；RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNA Marker（DL2000）购自TaKaRa公司；甜菜碱（Betaine）购自Sigma公司；超纯水购自Invitrogen公司。

1.2 毒株来源及样品处理猪肺炎支原体、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）SD1株、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）SA215株、猪圆环病毒2型（ Porcine circovirus type 2，PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）H株等的组织样本、核酸样本、细胞培养物为本实验室和上海实验动物研究中心保存。阳性组织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000 ×g离心15 min，收集上清液待检。

1.3 病毒核酸的提取取100 μL待检上清液或血清，采用Qiagen DNA Blood mini Kit提取猪肺炎支原体、PPV、PRV、PCV2基因组；采用Trizol提取PRRSV、TGEV基因组，再制备成cDNA保存备用。

1.4 LAMP引物设计从GenBank获取猪肺炎支原体的基因序列，通过软件分析和比对，使用Primer Explorer和LAMP Designer软件设计猪肺炎支原体的LAMP特异引物，共设计12组（P1～P12）针对不同基因保守区域的引物，经筛选鉴定，确定采用P1体系来扩增mhp165 基因，其具体序列见表1。

表1 P1引物Table 1 Primer 1

1.5 LAMP检测体系反应体系总体积（25 μL）：1×ThermPol缓冲液2.5 μL，模板DNA 2 μL，其余各组份的终浓度：MgSO48 mmol/L，甜菜碱1 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外引物（F3和B3）0.2 μmol/mL，内引物（FIP和BIP）1.6 μmol/mL，环引物（LF和LB）0.8 μmol/mL，Bst聚合酶8U。

1.6 LAMP检测体系的敏感度试验将提取的猪支原体肺炎基因组DNA分别稀释至0.4×10-1、0.4×10-2、0.4×10-3、0.4×10-4、0.4×10-5ng/μL，以无菌ddH2O为空白对照，按照63℃恒温反应60 min进行LAMP扩增，凝胶电泳判定结果。可视化检测：配制上述相同的体系，并在检测管的管盖上滴加2 uL SybrGreen显色液，小心盖好反应管盖，63℃运行60 min后，反应管颠倒混匀，肉眼判读结果。

1.7 LAMP检测体系的特异性试验配置与1.6相同的反应体系分装至6支LAMP反应管，再依次加入猪肺炎支原体、PRRSV、PPV、PRV、PCV2、TGEV等病毒核酸，按照63℃恒温反应60 min进行LAMP扩增，凝胶电泳判定结果。可视化检测：配制上述相同的体系，并在检测管管盖上滴加2 uL SybrGreen显色液，小心盖好反应管盖，63℃运行60 min，反应结束后，反应管颠倒混匀，肉眼判读结果。

1.8 LAMP检测体系的重复性、稳定性和实际样品检测以不同次提取的猪肺炎支原体核酸为模板进行5次LAMP；以不同批次水、Mg2+、Betaine、dNTP和酶为试剂，不同恒温设备，在不同时间和实验场所分别进行LAMP检测，依次分析本研究所建立方法的重复性和稳定性。将不同来源的8份猪肺炎支原体临床组织样本，分别采用PCR方法和建立的LAMP方法进行检测，鉴定两种检测方法结果是否一致。

2 结果

2.1 猪肺炎支原体LAMP特异性引物的筛选针对猪肺炎支原体不同的保守基因序列共设计了12套LAMP引物，将这些引物放入相同的LAMP反应体系中进行反应，以评估不同LAMP引物体系扩增的效果（P1-P4引物扩增结果为例）。结果显示，P1扩增猪肺炎支原体效果最显著，起峰早，扩增效率高（图1）。

图1 不同引物体系的扩增曲线图Fig. 1 Amplify curve of different primers

2.2 可视化猪肺炎支原体LAMP检测方法的敏感性将提取的猪支原体肺炎基因组DNA分别稀释至0.4×10-1、0.4×10-2、0.4×10-3、0.4×10-4、0.4×10-5ng/μL，再加入LAMP检测体系中。配完检测体系后，在检测管的管盖上滴加2 uL显色液，小心盖好反应管盖，63℃运行60 min。反应结束后，反应管颠倒混匀，肉眼判读结果。荧光温度检测显示，DNA模板量的下限达0.4×10-4ng/μL时，可见目的的条带的显著扩增（图2A）；DNA模板浓度等于或高于0.4×10-4ng/μL时，反应液显天蓝色，DNA模板浓度为0.4×10-5ng/μL及空白对照反应液均呈紫色（图2B）。

图2 猪肺炎支原体LAMP检测法的灵敏度Fig.2 The sensitivity test of LAMP for detecting Mycoplasma hyopneumoniae

2.3 可视化猪肺炎支原体LAMP检测方法的特异性配置含引物P1体系的LAMP反应管，除加入猪支原体肺炎核酸外，其余对照管分别加入PRRSV、PPV、PRV、PCV2、TGEV等病毒的核酸；并配完检测体系后，在检测管的管盖上滴加2 uL显色液（SybrGreen），小心盖好反应管盖，63℃运行60 min，反应结束后，反应管颠倒混匀，肉眼判读结果。结果显示，荧光强度检测显示，除猪肺炎支原体核酸管外，其余反应管核酸未扩增（图3A）；除含有猪肺炎支原体核酸检测管的反应液显天蓝色外，其余病毒反应液均呈紫色（图3B）。

图3 可视化猪肺炎支原体LAMP检测方法的特异性Fig.3 The speci fi city of visible LAMP for detecting Mycoplasma hyopneumoniae

2.4 猪肺炎支原体LAMP 检测方法的重复性、稳定性和实际样品检测以不同批次提取的猪肺炎支原体核酸为模板进行5 次LAMP，分析方法的重复性；分别以不同批次水、Mg2+、Betaine、dNTP和酶为试剂，不同恒温设备，在不同时间和实验场所分别进行LAMP检测，分析该方法的重复性和稳定性。结果表明，建立的猪肺炎支原体LAMP 方法具有良好的重复性和稳定性。将不同来源的8份猪肺炎支原体临床组织样本，分别采用PCR方法和本研究建立该LAMP方法进行检测，其检测结果一致。

3 讨论

在我国，地方猪种比引入猪种更易感染猪肺炎支原体。猪肺炎支原体经常和PRRSV、PCV2等病毒混合感染，造成重大的经济损失[6]。带菌猪是本病的主要传染源，病原体经气雾或与病猪的呼吸道分泌物直接接触传播，其经母猪传给仔猪使本病在猪群中持久存在，易感猪与带菌猪接触后，潜伏期为10 d或更长时间。由于猪肺炎支原体是通过气雾或直接接触传播，一旦感染较难清除，同时猪群的感染程度与猪场的管理水平、季节、通风条件和群体密度有很大的关系[7]。在猪只感染的早期检出猪肺炎支原体，对控制其传播、减少损失具有重要的意义。本研究在分析猪肺炎支原体保守基因序列的基础上，设计和比较了多套不同LAMP引物检测体系，从中筛选出了一组较理想的引物，建立了猪肺炎支原体LAMP检测方法，并检测了该方法的特异性和敏感性，证实了本研究建立的LAMP检测方法具有良好的敏感性，同时该方法特异性好，不与PRRSV、PPV、PRV、PCV2、TGEV等病毒核酸发生交差反应，可用于猪肺炎支原体与上述病原的鉴别诊断。在建立的常规LAMP检测方法的基础上，本研究在封密反应管前滴加显色液于反应管盖上，在温浴反应结束后，再颠倒反应管，让显色液与LAMP产物充分混合，提高了检测结果的可视化，增强了肉眼判定的准确性，同时在不打开反应管的条件下进行染色，避免了扩增产物气溶胶污染检测环境的可能性。目前，PCR是检测猪肺炎支原体的主要方法，该方法具有敏感度高，操作简便的特点，但需要在配备有设备的专业化实验室内完成[8,9]。本研究建立的可视化LAMP检测方法，除普通离心机和水浴锅外，几乎不需要其他设备，其检测的敏感性和可靠性不低于传统PCR方法，非常适合应用于猪场等条件简陋的一线实验室早期感染的监控；对于出入境口岸，该方法可应用于货物查验现场动物源性产品中猪肺炎支原体的快速监测，有助于提高阳性样品的检出率。

[1] Opriessnig T, Giménez-Lirola LG, Halbur P G.Polymicrobial respiratory disease in pigs[J]. Anim Health Res Rev, 2011, 12(2)∶ 133-148.

[2] 华利忠, 冯志新, 武昱孜, 等. 猪肺炎支原体净化检测程序研究进展[J]. 中国农学通报, 2012, 28(35)∶ 33-37.

[3] 韦艳娜, 白昀, 孔猛, 等. 猪肺炎支原体的分离方法[J].江苏农业学报, 2012, 28(1)∶ 104-107.

[4] 还红华, 邵国青, 倪艳秀, 等. 猪肺炎支原体培养技术研究[J]. 中国人兽共患病杂志, 2001, 17(3)∶ 70-71.

[5] 沈青春, 宁宜宝, 覃青松. 猪肺炎支原体的研究进展[J].中国兽药杂志, 2003, 37(6)∶ 26-30.

[6] Chae C. Porcine respiratory disease complex∶ Interaction of vaccination and porcine circovirus type 2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, andMycoplasma hyopneumoniae[J]. Vet J, 2016, 212∶ 1-6.

[7] Sibila M, Pieters M, Molitor T,et al. Current perspectives on the diagnosis and epidemiology ofMycoplasma hyopneumoniaeinfection[J]. Vet J, 2009, 181(3)∶ 221-231.

[8] Joyce Wanjiru Maingi, 熊祺琰, 韦艳娜, 等. 套式 PCR检测中国江苏省猪场猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染[J]. 中国人兽共患病学报, 2014, 30(8)∶ 800-805.

[9] 宋建领, 高华峰, 信爱国, 等. 猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 畜牧与兽医, 2013,45(5)∶ 71-74.

ESTABLISHMENT OF VISIBLE LAMP METHODS FOR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

XIONG Wei1, WANG Yan1, WEI Xiao-feng2, Li Chun-yang1, ZHANG Qiang1, HUANG Zhong-rong1,HU Jian-hua2, LI Jian1
(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China; 2.Shanghai Laboratory Animal Research center,Shanghai 201203, China)

S852.62

A

1674-6422（2017）04-0029-05

2012-02-23

上海市科委科研项目（14140900700）

熊炜，男，博士，研究员，从事病毒检测和分子生物学研究

王艳，E-mail：wang_yan@shciq.gov.cn