海洋地衣芽孢杆菌的絮凝活性研究及机理探讨

杨 波，司晓光，郝建安，张爱君，姜天翔，杜 瑾，王 静

(国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192)

海洋地衣芽孢杆菌的絮凝活性研究及机理探讨

杨 波，司晓光，郝建安，张爱君，姜天翔，杜 瑾，王 静*

(国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192)

以海洋地衣芽孢杆菌DHS-40为絮凝剂产生菌，通过定性测试鉴定所产微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分，采用程控混凝实验六联搅拌仪和重力沉降法评价其絮凝稳定性，通过扫描电子显微镜和原子力显微镜表征微生物絮凝剂和絮凝颗粒的微观形貌，并初步探讨了微生物絮凝剂的絮凝机理。结果表明，海洋地衣芽孢杆菌DHS-40所产微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分为多糖和蛋白质的混合物；当微生物絮凝剂投加量为0.05 g·L-1、环境pH值为4.0～8.0、环境温度为0～50 ℃时，絮凝活性达80%以上；絮凝活性基本不受环境pH值的影响，但在碱性较强(pH>8.0)时絮凝活性迅速下降，在pH值为10.0时完全丧失；微生物絮凝剂呈链状结构，且有深浅不等的沟回；絮凝颗粒呈层叠结构。微生物絮凝剂依靠电荷吸附和桥联作用带动水中的浑浊物共同沉降，从而达到净化水体的目的。

海洋地衣芽孢杆菌；微生物絮凝剂；絮凝活性；絮凝机理；桥联作用；电荷吸附

微生物絮凝剂(microbial flocculants，MBF)是利用生物技术培养絮凝微生物时产生的能使水体中悬浮的固体颗粒、胶体粒子及菌体细胞等凝集、沉淀的天然有机高分子聚合物[1-3]，其絮凝活性成分主要是多糖、蛋白质、糖蛋白、粘多糖、纤维素以及少量的脂类和核酸等微生物次生代谢产物，分子量约为几十万以上[4-5]。微生物絮凝剂安全、无毒、易降解、无二次污染、便于固液分离[6]，广泛应用于水处理、食品加工、化工、生物制药等领域。随着各类先进技术手段的广泛应用，微生物絮凝剂的絮凝活性被广泛研究、活性成分逐步被探知、絮凝微生物的培养条件不断被优化。絮凝微生物种类繁多、分布广泛、易于分离筛选，只在特定的生长阶段产生絮凝活性物质。微生物絮凝剂的絮凝特性各异，絮凝能力主要由微生物的分泌能力和絮凝活性特异产物的性质决定，絮凝效果除受自身发酵条件影响外，也与絮凝剂对水体颗粒物的吸附作用有关[7]。

目前，有关微生物絮凝剂及絮凝颗粒微观形貌的报道还不多，且缺乏直观的检测手段证明微生物絮凝剂具有较强的吸附和沉降能力。因此，作者以具有强絮凝特性的海洋地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)DHS-40为研究对象，对其絮凝活性成分进行鉴定，评价其絮凝稳定性，通过扫描电子显微镜和原子力显微镜分别对微生物絮凝剂和絮凝颗粒的微观形貌进行表征，并初步探讨了絮凝机理，拟为微生物絮凝剂的进一步研发奠定理论基础。

1 实验

1.1 菌株与培养基

海洋地衣芽孢杆菌DHS-40，来源于天津塘沽海河入海口污泥样品，由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所海水净化与水再利用技术研究室保存。

LB固体培养基：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉1.5%～2.0%，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，121 ℃高温蒸汽灭菌20 min。

优化发酵培养基：大豆油0.49%，豆粕水解液5.0 g·L-1，磷酸二氢钾0.2 g·L-1，氯化钙溶液(7.5 g·L-1)26 μL·L-1，硫酸锰溶液(2.0 g·L-1)260 μL·L-1，硫酸亚铁溶液(2.0 g·L-1)100 μL·L-1。

1.2 微生物絮凝剂的制备

取-80 ℃保存的DHS-40菌株，于LB固体培养基上划线活化培养，30 ℃传代活化2次。挑取单菌落转接到LB液体培养基中，30 ℃、180 r·min-1振荡培养72 h。将培养物继续接种至优化发酵培养基中，30 ℃、180 r·min-1振荡培养48 h。将发酵液5 000 r·min-1离心5 min，去除菌体细胞。上清液加入硫酸铵(分析纯)形成饱和溶液，冰浴静置3 h以上。于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。取沉淀，溶于水后喷雾干燥，即得微生物絮凝剂粉末。

1.3 絮凝活性的测定

取高岭土(化学纯)4.0 g加至盛有1 000 mL蒸馏水的烧杯中，置于六联搅拌仪上进行絮凝实验。絮凝实验分为3个阶段：(1)快速混合阶段：转速200 r·min-1，持续2 min，使高岭土在水中充分混匀，停止搅拌前添加0.05 g·L-1微生物絮凝剂；(2)反应阶段：转速30 r·min-1，持续20 min，使微生物絮凝剂在低转速水体中充分发挥作用；(3)静置阶段：搅拌停止后，使絮凝颗粒静置沉降15 min，吸取顶部上清液，测定剩余浊度。

1.4 絮凝活性有效成分的鉴定

将微生物絮凝剂粉末配制成10 g·L-1的活性溶液，分别进行糖类呈色反应(Molish反应、蒽酮反应、Seliwanoff反应、Benedict反应)、蛋白质类呈色反应(双缩脲反应、茚三酮反应)和脂类呈色反应(苏丹Ⅲ染色实验)，鉴定微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分。

1.5 絮凝稳定性评价

在微生物絮凝剂投加量为0.05 g·L-1的情况下，采用单因素实验，分别考察环境pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和环境温度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)对微生物絮凝剂的絮凝活性的影响。

1.6 微生物絮凝剂和絮凝颗粒的微观形貌表征

将微生物絮凝剂粉末粘贴在样品台上，经喷金处理后，于扫描电子显微镜下观察其微观形貌。

将高岭土悬浮液和絮凝颗粒分别涂布于样品台上，采用原子力显微镜轻敲模式(tapping mode)观察絮凝前后高岭土及絮凝颗粒的微观形貌。

2 结果与讨论

2.1 微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分

分别对微生物絮凝剂进行糖类呈色反应、蛋白质类呈色反应、脂类呈色反应，以鉴定其絮凝活性有效成分，结果见表1。

由表1可知，微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分为多糖和蛋白质的混合物，且不含脂类成分。

2.2 微生物絮凝剂的絮凝稳定性评价

不同微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分不同，其絮凝稳定性也不同。海洋地衣芽孢杆菌DHS-40所产的微生物絮凝剂主要活性成分为多糖和蛋白质，而蛋白质受环境pH值和环境温度的影响较大，因此，下面分别考察环境pH值和环境温度对絮凝活性的影响，以评价DHS-40所产微生物絮凝剂的絮凝稳定性。

表1絮凝活性有效成分鉴定结果

Tab.1Identificationresultsofflocculationactivecomponents

反应结果糖类呈色反应Molish反应+蒽酮反应+Seliwanoff反应+Benedict反应-蛋白质类呈色反应双缩脲反应(+)茚三酮反应+脂类呈色反应苏丹Ⅲ染色实验-

注：“+”表示阳性，“(+)”表示弱阳性，“-”表示阴性。

2.2.1 环境pH值对絮凝活性的影响(图1)

图1 环境pH值对絮凝活性的影响Fig.1 The effect of environmental pHvalue on flocculation activity

从图1可以看出，在环境pH值为4.0～8.0时，微生物絮凝剂的絮凝活性几乎不受酸碱度的影响，絮凝活性均保持在90%以上；当环境pH值大于8.0时，絮凝活性迅速下降；环境pH值为10.0时，丧失全部活性。这是因为，酸性条件下，带有正电荷的阳离子有利于絮凝剂与悬浮颗粒间的吸附与架桥，促进絮凝反应，加速矾花的生成和沉降；而当环境pH值升高时，引入大量带有负电荷的阴离子，导致悬浮颗粒间的排斥力增强，阻碍絮凝颗粒的吸附沉降，导致絮凝效率大幅下降，浊度迅速升高。因此推断，带有正电荷的阳离子可以促进絮凝反应的进行，带有负电荷的阴离子会导致絮凝活性有效成分蛋白质的变性失活以及絮凝颗粒间排斥力的增强，从而降低絮凝活性。

2.2.2 环境温度对絮凝活性的影响(图2)

从图2可以看出，絮凝活性基本不受环境温度的影响。当环境温度为0 ℃时，由于反应体系为冰水混合物，导致絮凝反应的矾花形成和沉降受到一定影响，絮凝活性略有下降，约为80%；而当环境温度超过0 ℃后，絮凝活性均在90%以上。

图2 环境温度对絮凝活性的影响Fig.2 The effect of environmental temperatureon flocculation activity

综上，微生物絮凝剂的絮凝稳定性很好，絮凝能力强，其絮凝活性基本不受环境温度的影响，并且在酸性、中性及弱碱性条件下都十分稳定，因此其储存与应用都十分便捷。

2.3 微生物絮凝剂的微观形貌(图3)

a～d的放大倍数分别为：500、1000、2000、4000

从图3可以看出，微生物絮凝剂主要呈链状结构，其链状结构上有深浅不等的沟回。推断其主要依靠链状结构上的离子进行电荷吸附发挥絮凝沉降作用，从而带动水中的浑浊物共同沉降，达到净化水体的目的。

2.4 絮凝颗粒的微观形貌

高岭土悬浮液在添加微生物絮凝剂前后的微观形貌如图4所示。

图4 高岭土悬浮液添加微生物絮凝剂前(a)后 (b)的原子力显微镜照片Fig.4 AFM images of kaolin suspension before(a) and after(b) adding microbial flocculant

从图4可以看出，高岭土悬浮颗粒十分松散，分子形貌呈扁平状，基本无交叠；添加微生物絮凝剂后，絮凝颗粒的比表面积明显增大，呈多层次交叠连接的复杂立体结构。此外，由于高岭土悬浮颗粒十分微小，激烈的布朗运动能够阻止其本身重力作用导致的沉降，从而引起水体的浑浊；加入微生物絮凝剂后，由于絮凝剂较强的吸附能力，高岭土悬浮颗粒通过电荷吸附以絮凝剂为核心包裹在其表面，再通过电荷吸附、架桥连接等相互作用形成结构紧密而庞大的稳定胶体，进而从水体中分离沉淀。

2.5 絮凝机理探讨

絮凝是十分复杂的过程，传统絮凝剂的作用机理主要有吸附桥联作用、电性中和作用、卷扫作用、基团反应、沉析物网捕作用等[8-12]。目前普遍认为，无机絮凝剂以电性中和作用为主，阳离子有机高分子絮凝剂以吸附桥联及电性中和作用为主，阴离子有机高分子絮凝剂以吸附桥联作用为主[13]。微生物絮凝剂的作用机理则更为复杂，主要原因是微生物絮凝剂是微生物在特定生长阶段分泌的生物高分子活性产物，不同微生物的性质和生长环境不尽相同，且微生物絮凝剂的成分复杂多样，提纯步骤较为繁琐。因此，研究者提出了多种特定环境下的絮凝机理，主要有荚膜学说、菌体外纤维素纤丝学说、电性中和学说、疏水学说和胞外聚合物架桥学说等[3]。

传统的水处理理论将天然水体中的各类胶体颗粒简化成均匀对称的球状。但实际情况是，水体中的各类胶体颗粒具有不同的大小、性状及厚度，且其表面电荷分布不均，势必会对胶体的絮凝特性产生影响，导致絮凝机理更加复杂。因此，单一的絮凝机理不能解释所有的微生物絮凝现象。本实验从海洋地衣芽孢杆菌DHS-40中分离提取到的微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分是多糖和蛋白质混合物，具有良好的稳定性和适用性。可以通过桥联、电荷吸附等作用形成复杂而稳定的立体絮网结构，明显改变水体中浑浊物的微观形貌，使得离散的悬浮颗粒互相粘附，进而胶体脱稳，生成絮体沉淀从反应体系中分离，达到净化水体的目的。

3 结论

海洋地衣芽孢杆菌DHS-40所产微生物絮凝剂的絮凝活性有效成分为多糖和蛋白质的混合物。在投加量为0.05 g·L-1、环境pH值为4.0～8.0、环境温度为0～50 ℃时，微生物絮凝剂的絮凝活性可达80%以上，当水体环境碱性增强(pH值>8.0)时絮凝活性迅速下降直至消失。微生物絮凝剂呈链状结构，且有深浅不等的沟回，絮凝颗粒呈层叠结构。微生物絮凝剂依靠电荷吸附和桥联作用带动水体中的浑浊物共同沉降，达到净化水体的目的。

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FlocculationActivityandMechanismofMarineBacilluslicheniformis

YANG Bo,SI Xiao-guang,HAO Jian-an,ZHANG Ai-jun,JIANG Tian-xiang,DU Jin,WANG Jing*

(InstituteofSeawaterDesalinationandMultipurposeUtilization,SOA,Tianjin300192,China)

Using marineBacilluslicheniformisDHS-40 as a flocculant-producing strain,we determined the active components of microbial flocculant by a qualitative experiment,evaluated flocculation stability by a six-combined agitator for program-controlled coagulation test and a gravity sedimentation method,characterized microscopic morphologies of microbial flocculant and flocculant particles by scanning electron microscope and atomic force microscope,and discussed flocculation mechanism.Results indicated that the active components of microbial flocculant of marineBacilluslicheniformiswere mixture of polysaccharides and proteins.The flocculation activity was above 80% when microbial flocculant dosage was 0.05 g·L-1,environmental pH value was 4.0～8.0,and environmental temperature was 0～50 ℃.Environmental pH value hardly affect the flocculation activity,however,the flocculation activity decreased rapidly under the alkaline environment(pH>8.0),and lost all when pH value was 10.0.The morphology of microbial flocculant possessed a chain structure with different depths and channels.The morphology of flocculant particles presented a stacked structure.Depended on charge adsorption and bridging action,microbial flocculant was settled together with the turbidity of water,thus achieved the goal of purifying water body.

Bacilluslicheniformis;microbial flocculant;flocculation activity;flocculation mechanism;bridging action;charge adsorption

TQ314.253 X703

A

1672-5425(2017)10-0040-04

海洋公益性行业科研专项项目(201405017-04)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(K-JBYWF-2016-G10)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(K-JBYWF-2017-T08)

2017-05-19

杨波(1982-)，女，河北人，工程师，研究方向：海洋微生物技术，E-mail：yangbo82@21cn.com；通讯作者：王静，教授级高级工程师，E-mail：Wang_nana@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.009

杨波，司晓光，郝建安，等.海洋地衣芽孢杆菌的絮凝活性研究及机理探讨[J].化学与生物工程，2017，34(10)：40-43.