响应曲面法优化南五味子多糖的提取工艺

唐 静，金利华，李英英，高 洁，王 燕，杨银霞

(1.陕西国际商贸学院医药学院，陕西 西安 710246；2.陕西师范大学化学化工学院，陕西 西安 710119；3.西北有色金属研究院，陕西 西安 710016)

响应曲面法优化南五味子多糖的提取工艺

唐 静1，2，金利华3，李英英2，高 洁1，王 燕1，杨银霞1

(1.陕西国际商贸学院医药学院，陕西 西安 710246；2.陕西师范大学化学化工学院，
陕西 西安 710119；3.西北有色金属研究院，陕西 西安 710016)

以蒸馏水为溶剂提取南五味子多糖，首先采用单因素实验考察了提取时间、液固比和提取温度对南五味子多糖提取率的影响；然后在单因素实验的基础上，以多糖提取率为指标，以提取时间、液固比和提取温度为变量，采用响应曲面法研究了各变量及其交互作用对多糖提取率的影响，并建立二次多项式回归方程预测模型。结果表明，在提取时间为3 h、液固比为20∶1(mL∶g)、提取温度为75 ℃时，多糖提取率达到最高，为3.14%，且与模型预测值接近。

南五味子；多糖；响应曲面法；优化；提取工艺

五味子是木兰科北五味子或南五味子的干燥成熟果实，也叫乌梅子、玄及、会及、山花椒等，是一种多功能、多用途的药食兼用型经济植物[1]。南五味子多糖是一种理想的免疫增强剂，有激活免疫细胞、提高免疫功能等作用[2-4]。近年来，由于植物多糖在医药等方面的重要作用，研究者对从天然植物中提取多糖表现出极大的兴趣，尤其是对多糖提取工艺的优化研究较多。在提取工艺优化方面应用较广泛的是响应曲面法(response surface methodology,RSM)，RSM可以探究各考察因素与响应值之间的关系及其交互作用，确定各因素对响应值的影响。响应曲面法采用Box-Behnken设计实验方案，在中心点反复进行实验，以提高实验精度，减少实验次数[5-6]，中心组合实验结合响应曲面分析拟合得到二次多项式模型，将数学方法和统计学方法结合起来，精确得到各因素与响应值之间的关系[7-9]。

作者在此通过单因素实验确定提取南五味子多糖的合理实验条件范围，并在此基础上，采用响应曲面法对南五味子多糖的提取工艺条件进行优化，以期为南五味子的综合利用提供帮助，为南五味子的药理活性和药用价值研究奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

南五味子，产自陕西省汉中市，清洗，烘干，备用。

无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水为二次蒸馏水。

DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；IKA RV8型旋转蒸发仪，德国IKA集团；PD-113-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；CP224S型电子天平，德国Sartorius集团；SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵，西安太康生物科技有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HC-1000Y型高速多功能粉碎机，永康天祺盛世工贸有限公司。

1.2 南五味子多糖的提取

将干燥的南五味子果实粉碎过40目筛，取5 g南五味子粉末于圆底烧瓶中，加入一定量二次蒸馏水，于恒温水浴中提取一定时间，抽滤，得提取液。将提取液在旋转蒸发仪中浓缩后加入一定量无水乙醇进行沉淀，静置24 h，过滤得沉淀物，即南五味子多糖。

1.3 南五味子多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[10]测定南五味子多糖含量。

标准曲线的绘制：配制0.995 mg·mL-1葡萄糖标准溶液，稀释成6个不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、1.00、1.20，mg·mL-1)的葡萄糖标准溶液。取各浓度标准溶液1.0 mL，加入1.0 mL 5.0%的新制苯酚溶液及5.0 mL浓硫酸，混匀，静置15 min，冷却10 min，测定492 nm处吸光度，以二次蒸馏水作为空白对照。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)，拟合数据得线性回归方程：y=10x+0.04767，相关系数R2=0.9983，线性范围0.02～0.12 mg·mL-1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

取一定量南五味子多糖，用二次蒸馏水溶解并定容于25 mL容量瓶中，精密移取1.0 mL按上述方法测定492 nm处的吸光度，以二次蒸馏水作空白对照。依据标准曲线得到南五味子多糖含量，计算多糖提取率。

1.4 南五味子多糖提取工艺优化

先采用单因素实验，分别考察提取时间、液固比、提取温度对多糖提取率的影响；然后在单因素实验的基础上，以多糖提取率为考核指标，采用响应曲面法优化南五味子多糖提取工艺。响应曲面法的因素与水平见表1。

表1响应曲面法的因素与水平

Tab.1Thefactorsandlevelsofresponsesurfacemethodology

因素水平-101A.提取时间/h234B.液固比/(mL∶g)5∶115∶125∶1C.提取温度/℃607080

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对多糖提取率的影响

称取南五味子粉末5.0 g于250 mL圆底烧瓶中，按液固比15∶1(mL∶g，下同)加入二次蒸馏水，在50 ℃水浴提取不同时间，考察提取时间对多糖提取率的影响，结果见图2。

从图2可以看出，多糖提取率随着提取时间的延长先升高后降低，在提取时间为3 h时，多糖提取率达到最高。

2.1.2 液固比对多糖提取率的影响

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extractionrate of polysaccharide

称取南五味子粉末5.0 g于250 mL圆底烧瓶中，分别按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1加入二次蒸馏水，50 ℃水浴提取3 h，考察液固比对多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 液固比对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extractionrate of polysaccharide

从图3可以看出，多糖提取率随着液固比的增大先升高后降低，在液固比为15∶1时，多糖提取率达到最高。

2.1.3 提取温度对多糖提取率的影响

称取南五味子粉末5.0 g于250 mL圆底烧瓶中，按液固比15∶1加入二次蒸馏水，分别在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃提取3 h，考察提取温度对多糖提取率的影响，结果见图4。

从图4可以看出，多糖提取率随提取温度的升高大体呈升高趋势，在提取温度为70 ℃时，多糖提取率达到最高。

2.2 响应曲面法实验

2.2.1 Box-Behnken设计实验结果与分析

根据单因素实验结果，以多糖提取率为指标，采用Box-Behnken设计17组实验，结果见表2。

采用Design-Expert 8.0软件对表2数据进行二次响应面回归拟合，得到多糖提取率(Y)与所考察的3个因素之间的二次响应面回归方程：Y=-12.93338+1.96575A-0.005025B+0.34293C-0.004AB+0.02325AC+0.002125BC-0.54700A2-0.00362B2-0.003095C2。

二次模型的方差分析结果见表3。

图4 提取温度对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extractionrate of polysaccharide

表2Box-Behnken设计实验结果

Tab.2Results of Box-Behnken design experiment

注：括号内为提取率预测值。

表3二次模型的方差分析

Tab.3Varianceanalysisfortheregressionquadraticmodel

来源平方和自由度均方F值P值显著性模型3.8990.4311.900.0018**A0.5110.5113.900.0074**B0.4310.4311.780.0110*C6.400E00310.102.790.1389AB0.0110.010.180.6872AC0.2210.225.950.0448*BC0.1810.184.970.0610A21.2611.2634.690.0006**B20.5510.5515.190.0059**C20.4010.4011.100.0126*残差0.2570.04失拟项0.1330.041.310.3865纯误差0.1340.03总和4.1516R2=0.9387 R2adj=0.8598

注：＊＊表示P<0.01，极显著差异；＊表示0.01

2.2.2 响应曲面分析

根据二次模型绘制各因素对南五味子多糖提取率影响的响应面图和等高线图，如图5所示。

从图5a可以看出，当提取温度相同时，延长提取时间多糖提取率先升高后降低；当提取时间相同时，升高提取温度多糖提取率也是先升高后降低，而且提取时间对多糖提取率的影响更大。这可能是因为，提取温度升高时，体系内分子热运动加快，南五味子多糖能更好地溶于水中；但提取温度过高，多糖结构会有一部分被破坏，导致多糖提取率略微下降；提取时间延长时，体系内热量慢慢聚集，分子热运动加快，体系中南五味子多糖能更好溶出；但提取时间过长，体系内会有部分热量损失，多糖提取率有所降低。当提取时间与提取温度都较高时多糖提取率达到最高。

图5 各因素相互作用的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour of the interaction among three factors

从图5b可以看出，在70 ℃、液固比相同时，多糖提取率随提取时间的延长出现先升高后降低的趋势；在70 ℃、提取时间相同时，多糖提取率随液固比的增大也出现先升高后降低的趋势，且变化趋势较提取时间平缓。这是因为，液固比较大时，体系内分子热运动的空间较大，多糖提取率升高；但液固比过高，体系的热量聚集程度下降，多糖提取率相应降低。当提取时间与液固比都较高时多糖提取率达到最高。

从图5c可以看出，提取温度对多糖提取率的影响与液固比有关，液固比较低时体系热能没有充分发挥作用，分子热运动没有达到最大，多糖提取率较低。当提取温度和液固比都较高时多糖提取率达到最高。

由Design-Expert 8.0软件得到南五味子多糖的最佳提取工艺参数为：提取时间3.31 h、液固比19.34∶1、提取温度74.47 ℃，理论提取率达到3.0381%。修正后的优化条件为：提取时间3 h、液固比20∶1、提取温度75 ℃。

2.3 验证实验

在优化条件下进行验证实验得到南五味子多糖提取率为3.14%，与预测值接近。表明优化得到的南五味子多糖提取工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。

3 结论

在单因素实验基础上采用响应曲面法对南五味子多糖提取工艺进行优化。结果表明：提取时间、液固比及提取温度对多糖提取率的影响大小顺序为：提取时间>提取温度>液固比。南五味子多糖提取工艺参数与多糖提取率的数学模型回归极显著，拟合度较好，可以用来优化南五味子多糖的提取工艺，优化后的提取条件为：提取时间3 h、液固比20∶1(mL∶g)、提取温度75 ℃，在此条件下，多糖提取率为3.14%。

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OptimizationinExtractionProcessofPolysaccharidesfromSchisandrasphenantheraRehd.etWilsbyResponseSurfaceMethodology

TANG Jing1,2,JIN Li-hua3,LI Ying-ying2,GAO Jie1,WANG Yan1,YANG Yin-xia1

(1.SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xi′an710246,China;
2.SchoolofChemistry&ChemicalEngineering,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710119,China;
3.NorthwestInstituteforNonferrousMetalResearch,Xi′an710016,China)

Polysaccharides fromSchisandrasphenantheraRehd.et Wils were extracted using distilled water as solvent,firstly,we investigated the effects of extraction time,liquid-solid ratio,and extraction temperature on the extraction rate by single-factor experiment.Then,based on the single-factor experiment,using extraction rate as an index,extraction time,liquid-solid ratio,and extraction temperature as variables,we studied the effects of each variable and their interactions on extraction rate by response surface methodology(RSM),and established the prediction model of quadratic polynomial regression equation.Results showed that,when extraction time was 3 h,liquid-solid ratio was 20∶1(mL∶g),and extraction temperature was 75 ℃,the extraction rate was the highest of 3.14%,which was close to the predicted value.

SchisandrasphenantheraRehd.et Wils;polysaccharide;response surface methodology;optimization;extraction process

TQ461 R284.2

A

1672-5425(2017)10-0049-05

陕西省教育厅专项科研计划项目(16JK2036)，2017陕西省大学生创新创业训练计划项目(2945)，陕西国际商贸学院校级课题(SMXY201605)，陕西国际商贸学院人才引进科研启动经费

2017-06-02

唐静(1982-)，女，陕西西安人，讲师，博士研究生，研究方向：溶液化学，E-mail：tangjing224@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.011

唐静，金利华，李英英，等.响应曲面法优化南五味子多糖的提取工艺[J].化学与生物工程，2017，34(10)：49-53.