不同提取剂下矮地茶高效液相色谱指纹图谱研究

王良贵

（丽水学院生态学院，浙江丽水323000）

不同提取剂下矮地茶高效液相色谱指纹图谱研究

王良贵

（丽水学院生态学院，浙江丽水323000）

建立不同提取剂的矮地茶高效液相色谱指纹图谱。比较乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯为提取溶剂对槲皮素、山奈酚、岩白菜素等3种有效成分提取的影响，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）构建不同地方来源矮地茶HPLC指纹图谱。结果表明，乙醇对槲皮素、山奈酚、岩白菜素等3种有效成分的提取效率最高，特征色谱峰明显，在特定色谱条件下的不同产地矮地茶HPLC指纹图谱相似度绝大部分大于0.8，色谱特征峰保留时间相对标准偏差均小于0.6%，可用于矮地茶HPLC指纹图谱的建立，为矮地茶药材资源的质量评价提供科学依据。

矮地茶；不同提取剂；反相高效液相色谱；指纹图谱

矮地茶为紫金牛科植物紫金牛Ardisia japonica（Hornst.）B1.的全株，产于长江流域以南各省区林下、谷地、溪旁阴湿处，性味为辛、微苦、平，归肺，肝经。治湿热黄疸、肝炎、急性肾炎、膀胱炎、肺结核盗汗、咯血、脱力劳伤、筋骨酸痛、月经不调、副鼻窦炎等[1-2]。现有文献表明，矮地茶中主要有效组分有香豆素类化合物（岩白菜素、异岩白菜素和三甲氧基异岩白菜素）、黄酮类化合物（槲皮素和山奈酚）、酮类化合物及多酚类化合物、三萜类和挥发油类[3]。《中国药典》2015版规定按干燥品计算矮地茶含岩白菜素不得少于0.50%，对槲皮素和山奈酚含量未作控制要求，但其药理作用表明，槲皮素和山奈酚也是其主要药理成分。因此，从岩白菜素、槲皮素和山奈酚等3方面来控制矮地茶药材质量更合理。

中药指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，能用于考察中药材产地、鉴别中药产品的原料药材真伪以及中药生产过程的质量控制[4]。目前，还未见结合指纹图谱以岩白菜素、槲皮素和山奈酚等3方面来控制矮地茶药材质量的报道。

本试验选取广西、河北、浙江三个地区的矮地茶为样本，采用乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯五种溶剂为提取剂，以岩白菜素、槲皮素、山奈酚为评价指标，建立矮地茶药材的RP-HPLC指纹图谱，为该药材地道鉴别与质量控制提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

UV-2401PC紫外-可见分光光度计（岛津公司），Agilent 1100型高效液相色谱仪，超声清洗仪（KQ-300DV，昆山市超声仪器有限公司）；槲皮素标准品（批号100081-200907），岩白菜素标准品（批号111532-201203）（购于中国食品药品检定研究院），山奈酚标准品（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甲醇、乙腈（色谱纯，美国天地有限公司），其他试剂为分析纯，水为超纯水。矮地茶样品分别购于河北保定、广西河池、浙江丽水三地的药农，经中药师鉴定。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量:20 μL;柱温：室温；其他见表1。

表1 色谱条件

1.2.2 标准品溶液的制备

分别准确称取槲皮素、山奈酚和岩白菜素标准品适量，以甲醇为溶剂制得浓度23.00，11.50，2.300，1.150，0.5750，0.2875mg·L-1槲皮素标准品溶液，以及 12.00，4.800，2.400，1.200，0.6000g·L-1山奈酚标准品溶液；以甲醇- 水（2：1，V/V）为溶剂制得浓度 10.42，4.170，2.083，1.042，0.5210g·L-1岩白菜素标准品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

取适量河北保定、广西河池、浙江丽水三地产矮地茶全株，100℃恒温干燥，研磨后过80目筛。取约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL提取剂，于37℃恒温水浴中超声提取45 min，G4砂芯漏斗过滤，取滤液，滤渣重复超声提取，在合并滤液中加入10 mL15%盐酸溶液，85℃下回流至无沉淀产生，旋蒸近干，转移至50 mL容量瓶，以甲醇洗涤、定容、混匀，过0.45 μm有机滤膜制得供试液，供RP-HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 标准工作曲线

对适宜浓度的槲皮素、山奈酚和岩白菜素标准品溶液绘制吸收曲线，得到各自最大吸收波长如表1所示。按优化的色谱条件1.2.1，采用外标定量法以色谱峰面积（A）与标准品溶液浓度（c）相关作线性回归，结果如表2，相应色谱图如图1，各色谱峰对称性均较好（＞1），理论塔板数大于2 500，符合药典对高效液相色谱法检测有效成分含量的规定要求。

表2 标准工作曲线

图1 3种标准品RP-HPLC色谱图

2.2 提取剂的影响

乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯和水等溶剂是中药有效成分常用提取剂，而且槲皮素对应的槲皮苷、山奈酚和岩白菜素在这些溶剂中也有一定溶解度，因此本试验考察了这些提取剂对提取效果的影响，结果见表3。由表3可见，五种提取剂中乙醇提取槲皮素、山奈酚、岩白菜素的能力最强，甲醇次之，水的提取能力较差。比较以乙醇提取3产地矮地茶中槲皮素、山奈酚、岩白菜素含量可知，每个地方产的矮地茶中有效成分含量有所差别，就岩白菜素含量看：广西河池产矮地茶含量最高，河北保定产矮地茶含量低。按2015年版《中国药典》（一部）规定矮地茶中岩白菜素含量不得低于0.5%的要求，河北保定与浙江丽水产矮地茶中岩白菜素含量低于此规定。按山奈酚含量：河北保定产矮地茶中含量最高，浙江丽水产的矮地茶中含量最低。3产地矮地茶中槲皮素含量相差不大。不同产地矮地茶中有效成分含量有所差别，究其原因不仅和当地的水土、地理气候环境有关，还和药材生长期的长短有关[5]。

表3 不同提取剂的影响

2.3 不同产地矮地茶HPLC指纹图谱

在中药的HPLC指纹图谱中，每一个特征色谱峰代表其内部一种化学成分，中药的药效是其内部各化学成分协同作用的结果，指纹特征与药效必然存在某种关联。因此为揭示不同产地矮地茶药效是否有差异，本试验分别将3个不同产地矮地茶以5种不同提取剂按方法1.2.3制备供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件测定，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A版）进行分析，获得不同产地矮地茶5种不同提取剂的HPLC指纹图谱叠加图（图2）。图2（a）是以槲皮素作考察指标的RP-HPLC指纹谱图，图2（b）是以山奈酚作考察指标的RP-HPLC指纹谱图，图2（c）是以岩白菜素为考察指标的RP-HPLC指纹谱图，图中S1～S5分别代表广西河池产矮地茶在乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯为提取剂色谱图，同样地，S6～S10、S11～S15分别代表浙江丽水、河北保定产矮地茶在乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯为提取剂色谱图，1号曲线是提取的共有特征谱图。从以上色谱图可见，以乙醇为提取剂的色谱峰容量相对较多，对目标成分具有良好的溶解能力，特征峰明显，对相似度评价影响小；由于流动相的不同，3组色谱图之间有较大差异，所以分别测定槲皮素、山奈酚和岩白菜素含量时应选取不同流动相达到良好的分离、净化；按夹角余弦法计算指纹图谱图相似度表明，在图2（a）中S2、S6、S11、S13、S15的相似度在0.8以上，在图2（b）中除S2、S7、S12外的其他色谱峰相似度在0.8以上，在图2（c）中色谱峰相似度在0.9以上，比较3组图中色谱特征峰保留时间相对偏差均小于0.6%，特征峰的精密度较高。

图2 RP-HPLC指纹图谱

2.4 方法的评估与讨论

2.4.1 精密度试验

取同一产地矮地茶样品6份，以乙醇为提取剂按方法1.2.3分别制备供试品溶液，在1.2.1的色谱条件下进样分析，考察槲皮素、山奈酚和岩白菜素等目标物的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果：3种目标物的保留时间基本相同，以槲皮素为参照计算得山奈酚和岩白菜素的相对峰面积RSDs值在1.20%～2.75%之间，符合指纹图谱技术要求中有关精密度试验的规定（RSDs＜3%）[6]，表明分析方法精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取同一供试品溶液，按1.2.1色谱条件分别于0，5，10，15，20，25 h进行测定槲皮素、山奈酚和岩白菜素，结果显示：3种目标物保留时间基本相同，以槲皮素为参照计算得山奈酚和岩白菜素的相对峰面积RSDs值小于3%。因此，供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

2.4.3 流动相的选择

以乙腈-0.4%冰醋酸为测定槲皮素时的流动相，考察了30 min内乙腈占不同体积比时供试液中槲皮素分离效果，乙腈占40%时槲皮素色谱峰保留时间短、分离度差，乙腈占25%的保留时间过长、分离度也差，因此选择乙腈-0.4%冰醋酸（30:70，V/V）为测定槲皮素的流动相；同样地优化了测定山奈酚流动相，结果如表1。开始以不同体积比的乙腈-水测定岩白菜素流动相，但存在色谱峰不能完全分离，后改用甲醇-水为流动相，考察了甲醇-水不同体积比下的色谱峰分离效果，结果如图3。由图3可见随着水的体积比增大，分离效果越好，但考虑到槲皮素等不溶于水的物质的影响，最后选择甲醇-水体积比35:65为测定岩白菜素流动相。

图3 甲醇-水体积比对岩白菜素测定影响

3 结论

在本研究中，针对矮地茶中3种主要有效成分槲皮素、山奈酚、岩白菜素，综合色谱峰峰形、峰面积、峰数目、各色谱峰分离度等情况，分别对5种提取剂（乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯）、流动相体系（乙腈-水、甲醇-水及加入不同浓度酸）等进行了优选，并从方法学上考察了建立的矮地茶HPLC指纹图谱的分析方法，表明所建立的方法可用于矮地茶的HPLC指纹图谱分析。

通过对3个不同产地矮地茶用5种提取剂所得HPLC图谱的分析，发现乙醇是槲皮素、山奈酚、岩白菜素等良好的提取剂，在某一色谱分析条件下的不同产地矮地茶HPLC图谱的整体峰形相差不大，按夹角余弦法计算所得指纹图谱图相似度绝大部分大于0.8，色谱特征峰保留时间相对偏差均小于0.6%，特征峰的精密度较高，基本符合国家药典对指纹图谱的要求，因此，可以用本方法监控矮地茶药材质量。

［1］上海中草药编写组，上海常用中草药编写组.上海常用中草药［M］.上海:上海科技出版社，1970.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京:中国医药科技出版社，2015:361.

［3］谢娟.矮地茶种质资源与主要止咳-抗炎组分的研究［D］.成都:西南交通大学，2008.

［4］李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望［J］.中草药，2013，44（22）：3095.

［5］徐昌艳，张丽艳，汪毅，等.苗药矮地茶的 HPLC指纹图谱研究［J］.中药材，2014，37（9）：1570.

［6］国家食品药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》的通知［J］.中成药，2000，22（10）：671.

A Study on HPLC Fingerprints of Ardisiae Japonicae Extracted with Different Solvents

WANGLianggui
（FacultyofEcology，Lishui University，Lishui 323000，Zhejiang）

Fingerprints of Ardisiae Japonicae developed from different extractants were established by the reverse phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）.The effects of different extractants including ethanol，water，methanol，n-butanol and ethyl acetate on the extraction of the active ingredients，such as quercetin,kaempferol and bergenin were compared.The RP-HPLC chromatograms of Ardisiae Japonicae botained from different producing areas and different extractants were evaluated using the software Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （Version 2004A）.The results showed that the extraction efficiency of ethanol of the above active ingredients is the highest among the five extractants，and the obtained chromatograms show the characteristic peaks clearly.The similarities of RPHPLC fingerprints of Ardisiae Japonicae from different places under the specific chromatographic conditions are mostly greater than 0.8，and the relative standard deviations of the chromatographic peak retention timeare less than 0.6%.So the developed RP-HPLC can be used for the establishment of the fingerprints of Ardisiae Japonicae，which provides the scientific basis for the quality evaluation of Ardisiae Japonicae medicinal materials.

Ardisiae Japonicae；RP-HPLC；different extractants；fingerprint chromatogram

10.3969/j.issn.2095-3801.2017.05.009

R282.7

A

2095-3801（2017）05-0054-07

2017-03-27；

2017-06-01

王良贵，男，江西临川人，讲师，硕士。