先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病一家系及PNPLA1基因突变分析

赵惠娟 闫慧敏 郭独一 朱培秋 雷鹏程 路雪艳 姜薇100191北京大学第三医院皮肤科

先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病一家系及PNPLA1基因突变分析

赵惠娟 闫慧敏 郭独一 朱培秋 雷鹏程 路雪艳 姜薇100191北京大学第三医院皮肤科

目的鉴定一先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病家系的致病基因，并探讨基因型与表型的关系。方法外周血中提取先证者及其哥、父母DNA，用全基因组外显子测序明确先证者的突变位点，根据突变位点设计特异性引物，用PCR来检测突变位点从而进一步确定该家系的致病原因。结果发现先证者PNPLA1基因的一条等位基因第4号外显子上700位的胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.700C＞T），导致了脯氨酸变成了丝氨酸（p.pro234ser），先证者哥也检测到相同突变；父母均为该突变基因的携带者，该突变在健康对照者中未检出。结论PNPLA1基因的错义突变（p.pro234ser）是引起该患者临床症状的特异突变。

遗传性疾病，先天性；染色体障碍；突变；基因，PNPLA1；先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病

先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病（autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI；OMIM242300）是一种以皮肤干燥、全身脱屑为主要特点的角质形成细胞分化障碍性疾病，有一定的遗传异质性，可伴有系统损害而出现相应的综合征。目前已证实该病的致病基因有 9 个：TGM1［1］、ALOX12B［2］、ALOXE3［2］、ABCA12［3］、NIPAL4 （ichthyin）［4］、CYP4F22［5］、CRE53［6］、LIPN3［7］、PNPLA1［8］，其中TGM1突变占34%～55%。PNPLA1基因自2012年首次发现为ARCI致病基因以来，迄今只报道5个家系。我们在临床中发现一个ARCI家系，在进行基因突变研究时发现，该家系由PNPLA1基因突变所致，进而对其发病的分子基础与临床表型之间的关系进行了探讨。

资料与方法

一、临床资料

先证者男（图1，Ⅳ2），14岁。因全身散在皮疹伴鳞屑14年就诊。患儿出生后无明显诱因全身出现不规则迂曲斑片，暗红色、覆有鳞屑、渐融合成片、无明显自觉症状，偶伴痒感。其哥（Ⅳ1）15岁，出生时呈火棉胶样婴儿表现，随年龄增长皮疹逐渐减轻。其父母均无类似疾病史，但为近亲结婚（Ⅲ1、Ⅲ2），见图1。先证者皮肤科检查：面部、前胸、下腹部、双下肢可见散在迂曲的暗红色、暗褐色斑上覆有灰白色鳞屑，部分皮损融合成片、鳞屑较厚，皮损部分边缘微隆起（图2A）。其哥仅见躯干、四肢皮肤干燥、粗糙，上覆细碎鳞屑（图2B）。两患儿毛发、指甲均正常；生长发育正常、智力正常；无睑外翻、唇外翻、耳聋等畸形。组织病理（取材于先证者及其哥股内侧皮肤）可见：①角化过度伴部分区域角化不全；②棘层肥厚；③表皮乳头瘤样增生；④真皮浅层血管周围以淋巴为主的炎症细胞浸润（图2C、2D）。诊断ARCI。2例患者经外用维生素E乳膏，早晚各1次，嘱患者洗澡后即刻涂抹保湿润肤剂，使用3个月后皮损明显减轻，鳞屑明显减少。正常对照取材来源于同年龄、同部位切除色素痣男性的正常皮肤。

图1 先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病家系图 近亲婚配

图2 先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病患者临床特点及组织病理 2A：先证者前胸、腹部皮损，可见暗褐色斑片，上覆灰白色鳞屑，部分区域融合成片；2B：先证者哥前胸、腹部皮损，可见前胸部皮肤干燥，上覆细碎鳞屑；2C、2D：先证者（2C）和先证者哥（2D）皮损组织病理 表皮角化过度伴部分区域角化不全，棘层肥厚，表皮乳头瘤样增生，真皮浅层血管周围以淋巴为主的炎症细胞浸润（HE×100）

二、提取基因组DNA

收集家系中先证者及其哥、父母及100例健康人静脉血4 ml，并用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度及纯度的测定。本研究通过北京大学第三医院医学伦理委员会批准，患者和健康人均签署知情同意书。

三、全基因组外显子测序

1.合格的DNA样本送深圳华大基因研究院，用NimbleGen商业化2.1M外显子序列捕获芯片进行外显子组区域的测序。整个样品制备过程包括杂交文库制备、芯片杂交洗脱以及杂交后测序文库制备，通过Illumina测序系统（IlluminaHiSeq 2000测序系统，美国Illumina公司）获得外显子序列信息。

2.测序验证：PNPLA1基因序列来自GenBank（NM_001145717），引物设计采用软件Primer3，在设计引物时，PNPLA1基因的8个外显子被分成8个片段，其中扩增4号外显子合成。引物：PNPLA1正向引物5′⁃CATGGGCCATTTCGATGTAC⁃3′，反向引物5′⁃CCTAGTCCCTGGTACCTTCT⁃3′，引物由北京天一辉远测序公司合成。分别对患者、其父母、正常人的DNA进行PCR反应。PCR反应采用25 μl体系，包括2 × mix 12.5 μl，10 ng的引物1 μl，ddH2O 9.5 μl以及100 ng的样本DNA 2 μl。PCR扩增条件为94℃预变性5 min后进入循环，94℃变性30 s，退火温度为58℃30 s，72℃延伸30 s，33个循环后72℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳分析，经酶纯化后用ABIPrism377型全自动测序仪测序（北京天一辉远测序公司）。

3.常染色体隐性遗传性鱼鳞病的临床表现千差万别，最常见表现为丑角鱼鳞病、板层状鱼鳞病和先天性非大疱性鱼鳞病样红皮病3种，诊断主要依据出生时或婴儿期皮损特点（多数出生时为胶样婴儿），以及遗传方式和分子生物学诊断。从临床表现上该家系先证者的哥哥出生时为胶样婴儿，2例患者的皮损表现符合ARCI三种亚型中的先天性非大疱性鱼鳞病样红皮病的表现；父母均不患病，且为近亲婚配；分子生物学检测证实该家系中的2例患者均为纯合突变，正常人100个等位基因验证并未发现该突变，而父母均为该致病基因PNPLA1（c.700C＞T）的携带者。因此明确诊断为ARCI。

图3 健康人皮肤及先证者皮损透射电镜（×12 000） 3A：健康人皮肤角质层；3B：先证者皮肤角质层，其中可见异常椭圆形脂滴（箭头）；3C：健康人的角质包膜；3D：患者的角质包膜，角质包膜不连续（箭头）

图4 测序结果及PNPLA1基因、蛋白质结构图 4A：PCR测序结果，Ⅳ1、Ⅳ2 PNPLA1第700位碱基由C突变为T，父母均为携带者，健康人第700位碱基为C；4B：PNPLA1基因结构（上排包含8个外显子，突变发生在4号外显子上）及蛋白质结构（下排包含2个结构域），红色箭头示该家系突变位点；黑色箭头示迄今世界上已报道的突变位点

结 果

1.透射电镜结果：①与正常对照（图3A、3C）相比，患者角质层数明显增多，高达40层；②患者皮肤角质层中出现了很多异常的椭圆形的脂滴（图3B）；③与正常人的皮肤中完整连续的角质包膜相比，患者皮肤电镜中角质包膜是不连续的（图3D）。

2.对先证者进行了全基因组外显子测序，后期进行筛选，最终将致病基因锁定为PNPLA1基因（NM_001145717），突变位点为4号外显子上700位的胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.700C＞T），导致了脯氨酸变成了丝氨酸（p.pro234ser）；后经直接测序验证先证者的哥哥同样存在相同突变，而父母均为携带者，在100例正常人中未发现该突变（图4）。该突变符合此家系的遗传方式，对测序结果与基因库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001145717）及Ensemble数据库（http：//www.ensemble.org/）所公布的序列进行比较，可排除单核苷酸多态性，并排除其他基因存在突变后，由此初步判断该家系的致病基因为PNPLA1。

讨 论

ARCI主要包括3种亚型：花斑型鱼鳞 病（harlequin ichthyosis，HI；OMIM 242500）、先天性非大疱性鱼鳞病样红皮 病（congenital ichthyosiformerythro⁃derma，CIE；OMIM 242100）及板层状鱼鳞 病（lamellar ichthyosis，LI；OMIM 242300、604777、601277、606545）［9］，不同类型的ARCI临床表现和严重程度迥异，其中HI是最严重致死的一种类型。目前已证实，与ARCI发病相关的有9个致病基因，其中相对少见的是CRE53、LIPN和PNPLA1，且目前已知的致病基因与临床表型尚无明确关系。PNPLA1基因位于6p21.31，自从2012年证实该病与PNPLA1基因突变有关以来［8］，全世界共报道了5个家系，其中4个错义突变，1个无义突变（图4B），2个家系来自阿尔及利亚［8］，2个家系来自巴基斯坦［10⁃11］，还有 1 个家系来自西班牙［12］。PNPLA1基因全长1 599 bp，包括8个外显子，编码533个氨基酸的蛋白质，PNPLA1蛋白属于马铃薯糖蛋白家族之一，PNPLA1蛋白有3个结构域（图4B），马铃薯糖蛋白结构域（Patatin区，第16～185位氨基酸）和脯氨酸富集疏水区（Pro_rich区，第326～ 451位氨基酸）［13］，目 前 PNPLA1 的 功 能 尚 不 清 楚［14］，PNPLA1蛋白除了在消化系统、骨髓、脾脏中高表达，在表皮颗粒层等其他组织中也有少量表达［13］。

通过全基因组外显子及PCR测序，我们发现，PNPLA1基因的错义突变（c.700C ＞T，p.Pro234Ser）是导致该家系中2例ARCI患者发病的主要原因。通过透射电镜观察，我们发现患者皮肤角质层中出现了很多异常的椭圆形脂滴，说明患者的脂质代谢途径存在异常，而脂类是角质包膜（cornified envelope，CE）不可分割的一部分；与正常人的皮肤中完整连续的CE相比，患者的CE是不连续的，说明患者CE的合成过程存在障碍。正常CE的形成是角质形成细胞正常分化的重要环节，也是皮肤屏障功能的重要组成成分，正常的角质包膜形成过程需要转谷氨酰胺酶，内披蛋白，兜甲蛋白，脂质等［15］。近年的研究表明，PNPLA1参与甘油磷脂的代谢［8］，甘油磷脂参与角质包膜的合成［16］，因此我们推测，PNPLA1突变导致脂质代谢障碍，影响正常角质包膜合成，影响角质形成细胞正常分化导致ARCI发生。我们的研究为进一步研究ARCI基因型与表型之间的关系提供了资料。

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第三届全国银屑病学术会议征文通知

为了让皮肤科医师了解国内外关于银屑病研究的最新动向，分享知名专家的临床诊治经验，中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会定于2018年9月21-23日在上海召开“第三届全国银屑病学术会议”。会议将邀请国内外知名专家报告他们在银屑病基础与临床的最新研究进展，演讲者报告形式多样、内容丰富。欢迎从事银屑病基础及临床研究的皮肤科医师和相关人员踊跃投稿和参会。

一、投稿要求：①投稿内容：银屑病基础研究论文、银屑病临床诊断和治疗等方面的论文、典型与疑难病例等；②投稿方式：中文全文和400字以内的中文摘要，请通过电子邮件投稿，Email：pfkxh@126.com。来稿请注明第三届全国银屑病学术会议征文，截稿日期：2018年8月1日；③会议交流形式：特邀演讲、大会发言、分会发言、书面交流。

二、联系方式：上海市黄浦区成都北路500号峻岭广场19楼1908室，上海长征医院《中国真菌学杂志》编辑部，邮编200003，Email：pfkxh@126.com，联系人：施慧，021-81885497，手机13764560811。

Mutation analysis of the PNPLA1 gene in a family with autosomal recessive congenital ichthyosis

Zhao Huijuan,Yan Huimin,Guo Duyi,Zhu Peiqiu,Lei Pengcheng,Lu Xueyan,Jiang Wei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

Jiang Wei,Email:jiangwei7366@163.com

ObjectiveTo identify a causative gene of autosomal recessive congenital ichthyosis（ARCI）in a Chinese family,and to analyze the genotype⁃phenotype correlation.MethodsPeripheral blood samples were collected from the proband,his elder brother and parents,and genomic DNA was extracted from these blood samples.Genome⁃wide exome sequencing was conducted to determine the mutation site in the proband,and then allele⁃specific oligonucleotide primers were designed based on the mutation site.PCR was performed to detect the mutation site to further identify the causative gene of ARCI in the family.ResultsA new homozygous missense mutation was identified in exon 4 in 1 allele of the PNPLA1 gene in the proband,which led to a codon change from cytosine（C）to thymine（T）at position 700（c.700C ＞ T）and resulted in the substitution of proline by serine（p.pro234ser）.The same mutation was also detected in the proband′s brother,and his parents were the mutation carriers.No mutations were found in unrelated healthy Chinese individuals.ConclusionThe missense mutation in the PNPLA1 gene（p.pro234ser）is associated with clinical symptoms of the patient with ARCI.

Genetic diseases,inborn;Chromosome disorders;Mutation;Genes,PNPLA1;Autosomal recessive congenital ichthyosis

姜薇，Email：jiangwei7366@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.06.005

国家自然科学基金（81201216）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81201216）

2016⁃09⁃28）

（本文编辑：吴晓初）