硫嘌呤甲基转移酶个体化检测在慢性光化性皮炎患者中的意义和应用

江雪 韩晓凤 钱思宇 史丙俊 刁庆春

400011重庆市第一人民医院 重庆市中医院皮肤科

硫嘌呤甲基转移酶个体化检测在慢性光化性皮炎患者中的意义和应用

江雪 韩晓凤 钱思宇 史丙俊 刁庆春

400011重庆市第一人民医院 重庆市中医院皮肤科

目的研究慢性光化性皮炎患者口服硫唑嘌呤后不良反应的发生与硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）活性及基因型的关系，探讨慢性光化性皮炎患者硫唑嘌呤优化用药方案。方法70例口服硫唑嘌呤治疗的慢性光化性皮炎患者纳入病例组，其中12例出现药物不良反应（不良反应组），58例未出现药物不良反应（无不良反应组）。同时，50例健康体检者作为对照组。取EDTA抗凝血2 ml，制备红细胞裂解液，采用高效液相色谱法测定TPMT活性。从全血中提取全基因组DNA，采用等位基因特异性PCR（AS-PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测TPMT基因型。结果慢性光化性皮炎患者TPMT活性为（25.80±8.34）U/ml，对照组为（23.58±5.70）U/ml，两组差异无统计学意义（t=0.782，P＞0.05）。不良反应组TPMT活性为（18.86±9.22）U/ml，无不良反应组为（27.27±6.72）U/ml，不良反应组TPMT活性明显低于无不良反应组（t=3.437，P＜0.05）。测定2组共120份样本TPMT基因型，发现基因突变7例（患者5例，健康对照2例），均为TPMT*3C（A719G）型杂合突变，基因型突变频率为5.8%，等位基因突变频率为2.9%。病例组与对照组TPMT*3C突变频率差异无统计学意义（χ2=0.108，P=0.742）。12例有不良反应者中发现TPMT*3C型突变3例，58例无不良反应者中2例，有不良反应组基因突变频率显著高于无不良反应组（χ2=40.093，P＜0.05）。结论慢性光化性皮炎患者口服硫唑嘌呤出现的不良反应与TPMT基因突变及低TPMT活性有关，积极调整低活性、突变型TPMT患者的药物剂量能实现更安全的治疗。

皮炎，光变态反应；硫唑嘌呤；药物毒性；DNA突变分析；硫嘌呤甲基转移酶

硫嘌呤甲基转移酶（thiopurine methyltransgerase，TPMT）是存在于人体内的一种非金属依赖性酶，能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）作为甲基的供体与底物结合，特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子的甲基化。TPMT活性由基因多态性调控，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。89%的人带有高活性TPMT等位基因纯合子（TPMTH），11%具有中等活性的杂合子，1/300的人表现出酶活性完全缺失，即低活性TPMT等位基因纯合子（TPMTL）；中等活性者及活性完全缺失者在使用标准计量的硫嘌呤类药物时出现不良反应的风险更高［1］。TPMT活性受多因素影响，导致酶活性基因型和表现型不能完全统一。TPMT遗传具有单基因共显性遗传特征，目前发现的突变类型超过35种，由专门的TPMT命名委员会命名［2］。常见类型为TPMT*2（G238C）、TPMT*3A（G460A 和 A719G）、TPMT*3B（G460A）和TPMT*3C（A719G），占总突变的95%以上［3］。我们通过研究慢性光化性皮炎患者服用硫唑嘌呤后不良反应发生情况，分析TPMT活性和TPMT基因型与硫唑嘌呤不良反应的关系，以降低患者在服用过程中不良反应发生的概率，提高治疗安全性。

对象与方法

一、临床资料

2015年2-12月在重庆市第一人民医院（重庆市中医院）皮肤科门诊确诊的70例慢性光化性皮炎患者纳入病例组，其中男54例，女16例，年龄14～83（47.37± 1.82）岁。2016年7-9月在同院体检中心体检的50例健康人作为对照组。所选病例均符合慢性光化性皮炎诊断，2个月内未接受输血，1个月内未接受任何免疫抑制剂治疗，无其他免疫性皮肤病及系统疾病。70例患者口服硫唑嘌呤后，12例出现药物不良反应（不良反应组），58例未出现（无不良反应组）。不良反应包括头晕、呕吐、腹泻和骨髓抑制（白细胞计数＜3.0×109/L或中性粒细胞＜1.5×109/L）等，其中，中性粒细胞＜0.5×109/L且持续2周以上为严重骨髓抑制。本研究通过重庆市中医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

二、仪器和试剂

1260系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司），DU800紫外/可见光分光光度仪（美国Beackman公司），MJ mini PCR扩增仪、凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；D3010全血全基因组提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司），Taq酶扩增混合液［天根生化科技（北京）有限公司］，限制性内切酶ACCⅠ和MwoⅠ（美国New England Biolabs公司）。

三、红细胞TPMT活性检测

采用高效液相色谱法测定TPMT的活性，以37℃每小时每毫升红细胞催化生成1 nmol 6-甲基巯基嘌呤来表示TPMT的活性单位。

1.红细胞裂解液的制备：用真空EDTA抗凝管采集患者全血2 ml。取1 ml全血至1.5 ml微量离心管（EP）中，2 800×g4℃离心10 min，去血清，留沉淀细胞。加入1 ml生理氯化钠溶液重悬，同上述步骤离心，去上清液，留沉淀细胞。重复3次。加入与沉淀等体积的生理氯化钠溶液重悬细胞，取100 μl重悬细胞液至1.5 ml EP管中。最后加入2倍体积的灭菌超纯水，枪头吹打混匀。4℃11 000×g离心1 min，将上清液（红细胞裂解液）移至新1.5 ml EP管中，如不能及时检测，可于-80℃冻存待用。

2.TPMT活性的检测：在300 μl红细胞裂解液中快速加入新鲜配制的3 mmol/L巯基嘌呤100 μl和1.2 mmol/L SAM 50 μl的混合液，涡旋 30 s，置于38℃恒温摇床中精确孵育1 h。取出EP管后，向每管快速加入50 μl 72%高氯酸溶液，涡旋混匀，终止反应。将EP管11 000×g离心15 min。吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱柱中测定。

3.高效液相色谱测定条件：色谱柱为Sepax Bio-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm，大连依利特公司）；流动相：乙晴∶超纯水（10∶90，v/v），加入二硫苏糖醇（DDT），终浓度为0.5 mmol/L；流速为1 ml/min；紫外线波长310 nm；发射波长390 nm；柱温35℃；进样量50 μl。

四、TPMT基因型检测

1.引物设计：采用在线Primer3软件设计引物序列，分别在第5、7、10号外显子上设计G238C、G460A和A719G突变位点。设计引物序列见表1。

2.全血全基因组DNA提取：按照Magen全血全基因组DNA提取试剂盒说明书，提取基因组DNA。最后加入55 μl TE缓冲液溶解DNA。经分光光度仪测定，A260/A280值在1.8～2.0间。DNA在-20℃保存用于TPMT基因型鉴定。

3.G238C突变位点的检测：采用等位基因特异性 PCR（AS-PCR）检测 G238C位点的突变。TPMT238F1/TPMT238R和TPMT238F2/TPMT238R两对引物分别扩增同一DNA样本。PCR反应体系：2 × Taq酶PCR Mixture缓冲液5 μl，上下游引物各0.2 μl，DNA 模板 0.5 μl，去离子双蒸水补足至10 μl。扩增条件采用降落PCR（Touchdown PCR），初始解链温度54℃，每1个循环降低1℃。连续10个循环后，再以解链温度50℃扩增26个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶分析。野生型基因纯合子可被TPMT238F1/TPMT238R引物扩增得到245 bp产物；突变型基因纯合子可被TPMT238F2/TPMT238R引物扩增得到245 bp产物；突变型基因杂合子可同时被上述2对引物扩增出245 bp产物。

4.G460A突变位点的检测：采用限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测G460C位点的突变。采用TPMT460F/TPMT460R配对引物扩增DNA样本，反应体系和条件均同前。扩增产物片段大小为711 bp。扩增产物用限制性内切酶MwoⅠ60℃消化3 h，酶切产物用2%琼脂糖凝胶分析。野生型基因纯合子被切割为282 bp和429 bp片段；突变型基因纯合子因酶切位点被破坏不能被切割，仍为711 bp片段；突变型基因杂合子则有分别为711、429和282 bp 3条片段。

表1 PCR引物

5.A719G突变位点的检测：采用TPMT719F/TPMT719R配对引物扩增DNA样本，反应体系和条件同前。扩增产物片段大小为373 bp。扩增产物用限制性内切酶ACCⅠ37℃消化3 h，酶切产物用2%琼脂糖凝胶分析。野生型基因纯合子不被切割，片段长度仍为373 bp；突变型基因纯合子因突变产生酶切位点，被切割成283 bp和90 bp 2条片段；突变型基因杂合子则有分别为373、283和90 bp 3条片段。

五、统计学分析

使用SPSS17.0软件进行统计分析。经正态性检验（Kolmogorov-Smimov法和Shapiro-Wilk法），TPMT活性数据呈正态分布，用x±s描述数据，采用两独立样本t检验分析；计数资料采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、红细胞TPMT活性与硫唑嘌呤不良反应

经高效液相色谱测定，对照组TPMT活性为11.67～ 48.93（23.58± 5.70）U/ml，慢性光化性皮炎患者为4.28～ 53.62（25.80± 8.34）U/ml，两组差异无统计学意义（t=0.782，P=0.439）。120例研究对象中，女性TPMT活性为（24.73±5.22）U/ml，男性为（25.62±6.78）U/ml，男女差异亦无统计学意义（t=1.027，P=0.566）。

慢性光化性皮炎患者中，有不良反应组TPMT活性为（18.86±9.22）U/ml，无不良反应组为（27.27±6.72）U/ml，不良反应组明显低于无不良反应组，差异有统计学意义（t=3.437，P＜0.05）。高活性TPMT者（＞40 U/ml）3例，均未出现不良反应，而中等活性者（10～40 U/ml）及低活性者（＜10 U/ml）共67例，其中12例出现不良反应，55例未出现不良反应。不同TPMT活性患者不良反应发生率差异无统计学意义（χ2=2.074，P=0.369）。不良反应中，多为头晕、恶心等轻度不良反应，2例在服药2周后出现轻度血液系统危象：1例白细胞计数＜3.0×109/L，1例中性粒细胞＜1.5×109/L，这2例患者均为TPMT*3C杂合子基因型突变，平均TPMT活性为12.41 U/ml。

图1 G238C、G460A和A719G基因型突变检测琼脂糖凝胶电泳图 1A：G238C基因型突变检测，1、3：TPMT238F1/TPMT238R引物扩增产物，均为245 bp，2、4：未扩增出TPMT238F2/TPMT238R引物扩增产物，5：标准参照物；1B：G460A基因型突变检测的琼脂糖凝胶电泳图，1：标准参照物，2、4：扩增产物，均为711 bp，3、5：MwoⅠ60℃消化3 h后的产物片段，可见429和282 bp片段；1C：A719G基因型突变检测的琼脂糖凝胶电泳图，1、3：扩增产物，373 bp，2、4：ACCⅠ37℃消化3 h后的产物片段，可见泳道2中有373、283和90 bp片段（90 bp片段过小，在凝胶中分辨率较低），而泳道4中仍为373 bp产物，5：标准参照物

二、TPMT基因型与硫唑嘌呤不良反应

测定2组共120份样本TPMT基因型，部分凝胶电泳结果如图1所示。共发现基因突变7例，其中患者5例（7.1%），健康对照2例（4.0%），均为TPMT*3C（A719G）型杂合突变，基因型突变频率为5.8%，等位基因突变频率为2.9%。病例组与对照组TPMT*3C突变频率差异无统计学意义（χ2=0.108，P=0.742）。

病例组12例有不良反应者中，发现TPMT*3C型突变3例，基因型突变频率为25%，等位基因突变频率为12.5%；58例无不良反应者中，TPMT*3C型突变2例，基因型突变频率为3.4%，等位基因突变频率为1.7%，有不良反应组基因突变频率显著高于无不良反应组，差异有统计学意义（χ2=40.093，P=0.043）。基因突变型（TPMT*3C）低活性率为20.0%，野生型（TPMT*1）为1.5%，基因突变型人群TPMT低活性发生率明显低于野生型人群，因例数太少，未做统计学分析。

讨 论

近年来药物遗传学和药物基因组学研究迅速发展，使临床医师更加重视个体化用药方案。TPMT活性和遗传多态性与硫嘌呤类药物疗效及不良反应间的密切联系已被证实。TPMT活性和基因型的检测在国外已逐渐作为硫嘌呤类药物使用前的常规检查，尤其在皮肤科医生中使用率更高［4-5］。英国的一份调查显示［6］，67%英国临床医生会在患者服用硫唑嘌呤前进行TPMT检测。而在2005年，FDA将给药前的TPMT基因型检测列入硫唑嘌呤/巯基嘌呤的药品说明书中［7］，英国国家药典也建议在使用巯基嘌呤类药物前应进行TPMT检测。但目前该项检测仅在国内少部分三甲医院开展，且并未得到皮肤科医生的重视。

硫嘌呤类药物在临床中的使用存在个体差异，其原因最早于1970年代末Weinshiboum等［8］在人红细胞中发现TPMT的差异而被人所熟知。随后他们展开了一系列研究，同样也在淋巴细胞、肝组织、肾组织中发现了TPMT活性水平的差异。用药后的药物监测存在滞后性，不能从根本上解决TPMT缺乏导致的一系列不良反应。因此，首次给药前的TPMT检测能够帮助临床制订更为安全有效的给药方案。

本研究显示，发生不良反应的患者TPMT基因型突变率明显高于未发生不良反应者，提示患者服用硫唑嘌呤后出现的不良反应可能与TPMT基因突变有关。硫嘌呤类药物在体内有3条代谢途径，其中TPMT代谢途径最为重要。TPMT是硫嘌呤类药物体内代谢的关键酶，当TPMT发生突变时，酶活性受到影响（酶活性降低或丢失），直接导致机体对硫嘌呤类药物的代谢，导致鸟嘌呤核苷酸（TGNs）产物堆积过剩，进入细胞内引发DNA和RNA损伤、细胞凋亡，最终导致不良反应的发生。鉴于口服硫唑嘌呤个体差异较大，并与TPMT基因突变有关，为降低不良反应发生率，指导临床医生用药，2011年美国临床遗传药物学行业协会在Nature上发布了TPMT基因型检测和巯基嘌呤用量的指南［9］。

但在研究中我们也发现，有小部分明确基因型突变的慢性光化性皮炎患者对口服硫唑嘌呤有良好的耐受性，且治疗效果显著，而有一些患者虽没有明确的基因型突变，但却出现一定程度的不良反应，提示TPMT基因型与表现型不完全一致。本研究显示，采用TPMT基因突变预测口服硫唑嘌呤不良反应的发生准确性达84.3%（59/70）。有研究发现［10］，健康志愿者TPMT活性和基因型的一致性达到98.4%，而在中等活性人群中两者的一致性降至86%。研究表明［11］，TPMT基因型较红细胞TPMT活性在预测药物不良反应上更准确，更适用于药物前的初始筛查，而两者联合检测，能有效降低TPMT缺失的漏检率［12］，从而更好地降低药物使用风险，为患者进行更优化的个体化治疗。因此，研究人员更推荐将基因型作为用药前的初始检测，基因型检测能够降低将TPMT缺失误检为TPMT中等活性的风险［11］。因TPMT活性过高需要增加用药剂量以达到疗效的患者，及部分基因型正常但酶中等活性的人群则需要进行表型检测。

近年已有文献报道除TPMT外，ITPA、HPRT、XO、IMPDH等酶均与硫嘌呤类药物代谢相关，但本研究仅分析了TPMT代谢酶。此外，还有一些TPMT未知突变位点也未考虑。因此，今后还需进行大样本前瞻性研究，进一步优化硫嘌呤类药物的个体化应用。

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·读者·作者·编者·

论文中有关实验动物的描述

目前，使用各种动物进行的实验性研究越来越多，但我们发现，作者对实验动物所作的描述很不完整。根据1988年颁布的中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号《实验动物管理条例》和卫生部1998年颁布的《医学实验动物管理实施细则》，论文中有关实验动物的描述，要求写清楚以下事项：①品种、品系及亚系的确切名称；②遗传背景或其来源；③性别、年龄、体重；④质量等级及合格证编号；⑤饲养环境和实验环境；⑥健康状况；⑦对实验动物的处理方式。医学实验动物分为四级：一级为普通级，二级为清洁级，三级为无特定病原体（SPF）级，四级为无菌级。卫生部级课题及研究生毕业论文等科研实验必须应用二级以上的实验动物。

Significance and application of individualized detection of thiopurine S-methyltransferase in patients with chronic actinic dermatitis

Jiang Xue,Han Xiaofeng,Qian Siyu,Shi Bingjun,Diao Qingchun
Department of Dermatology,Chongqing First People′s Hospital and Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400011,China

Diao Qingchun,Email:qchundiao@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate correlations of thiopurine S-methyltransferase（TPMT）activity（phenotype）and genotype with adverse reactions after oral azathioprine treatment in patients with chronic actinic dermatitis,and to explore optimal azathioprine dose for the treatment of chronic actinic dermatitis.MethodsTotally,70 patients with chronic actinic dermatitis treated with oral azathioprine were enrolled into this study and served as patient group,of whom,12 had adverse reactions to azathioprine.In addition,50 health checkup examinees were enrolled as the control group.EDTA-anticoagulated blood samples were collected from the patients and controls,and erythrocytes lysates were prepared.High performance liquid chromatography（HPLC）was performed to evaluate the activity of TPMT.Genome-wide DNA was extracted from the blood samples,and TPMT genotypes were detected by allele-specific PCR and PCR-restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis.ResultsThere was no significant difference in the TPMT activity between the patient group and control group（［25.80 ± 8.34］U/mlvs.［23.58±5.70］U/ml,t=0.782,P＞0.05）.However,the TPMT activity was significantly lower in patients with adverse reactions than those without（［18.86 ± 9.22］U/mlvs.［27.27 ± 6.72］U/ml,t=3.437,P＜0.05）.TPMT genotypes were detected among 120 samples,and a heterozygous mutation TPMT*3C（A719G）was found in the TPMT gene in 7 samples,including 5 in the patient group and 2 in the control group.The frequencies of the mutant genotype and allele were 5.8%（7/120）and 2.9%respectively.No significant difference in the frequency of TPMT*3C mutation was observed between the patient group and control group（χ2=0.108,P=0.742）.The TPMT*3C mutation was found in 3 of the 12 patients with adverse reactions,as well as in 2 of 58 patients without adverse reactions.Additionally,the frequency of TPMT*3C mutation was significantly higher in patients with adverse reactions than in those without（χ2=40.093,P＜ 0.05）.ConclusionAdverse reactions after oral azathioprine treatment are associated with TPMT mutations and decreased TPMT activity in patients with chronic actinic dermatitis,so appropriately adjusting the azathioprine dose in patients with low-activity and mutant-type TPMT can facilitate safe treatment.

Dermatitis,photoallergic;Azathioprine;Drug toxicity;DNA mutational analysis;Thiopurine methyltransferase

刁庆春，Email：qchudiao@vip.sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.009

重庆市中医院院内培育课题（2209014313）

Fund program:The intramural research program of Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital（2209014313）

2016-06-22）

（本文编辑：周良佳 颜艳）