4-羟苯基维胺在不同载体中对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡影响

李周娜 陈香儒 金哲虎

133000吉林延吉，延边大学附属医院皮肤科

4-羟苯基维胺在不同载体中对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡影响

李周娜 陈香儒 金哲虎

133000吉林延吉，延边大学附属医院皮肤科

目的探讨4-羟苯基维胺（4-HPR）在不同载体中对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKF）增殖及凋亡的影响。方法采用薄膜-超声分散法制备4-HPR脂质体溶液及4-HPR微泡溶液。用不同浓度（0～80 mg/L）4-HPR脂质体溶液作用原代HKF 6～48 h后，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况。将部分HKF分成3组，分别用15 mg/L 4-HPR溶液、4-HPR脂质体溶液、4-HPR微泡处理，每组再分成两个亚组，一个亚组在给药后接受超声处理，另一亚组不做超声处理。作用24 h后，噻唑蓝（MTT）法检测HKF的增殖情况。流式细胞仪检测15 mg/L 4-HPR脂质体或4-HPR微泡处理24 h后HKF的凋亡情况。结果成功制备4-HPR脂质体溶液及4-HPR微泡溶液。MTT检测显示，4-HPR脂质体溶液在1～80 mg/L浓度范围内对HKF增殖有抑制作用，且增殖抑制率与药物浓度呈正相关（r=0.633，P＜0.01）。超声处理后4-HPR微泡组与4-HPR溶液及4-HPR脂质体组对HKF的增殖抑制作用差异均有统计学意义（P＜0.01）。4-HPR脂质体组和4-HPR微泡组HKF凋亡率分别为（21.81±3.73）%和（39.79±1.61）%，较对照组（6.18±0.61）%均显著增加（均P＜0.01）。结论成功制备4-HPR微泡，不同载体中4-HPR可促进HKF凋亡，进而抑制增殖，其中4-HPR微泡结合超声抑制作用较4-HPR脂质体强。

维甲酸；瘢痕疙瘩；成纤维细胞；细胞增殖；4-羟苯基维胺

维A酸类药物对体外培养的成纤维细胞（fibroblast，FB）DNA合成具有干扰作用，可抑制成纤维细胞增殖及胶原代谢［1］。4-羟苯基维胺（4-hydroxyphenyl-retinamide，4-HPR）是人工合成的全反式维A酸文献显示，4-HPR对多种恶性肿瘤细胞有较高的抗肿瘤活性，毒性低于其他维A酸类药物［2］。临床上瘢痕疙瘩有肿瘤样生长的特性，推测4-HPR也可用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗。但4-HPR水溶性差，直接给药效果不佳。为了开发一种治疗瘢痕疙瘩的纳米药物载体，提高4-HPR的溶解度，我们结合超声波技术，研究4-HPR对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKF）增殖及凋亡的作用，为临床上更好地治疗瘢痕疙瘩提供依据。

材料与方法

一、材料

1.细胞株：将瘢痕疙瘩原代培养保存于液氮中的HKF（来自中国医学科学院药物研究所）取出，复苏，在37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞长满90%时传代，取第3～5代细胞用于实验。

2.主要试剂和仪器：流式细胞仪（FACS Calibur）产自美国BD公司；超声波细胞粉碎机（JY92-IIN）产自宁波新芝生物科技股份有限公司；4-HPR产自南京圣赛化工有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒产自上海贝博生物科技有限公司；噻唑蓝（MTT）、胆固醇、甲醇（HPLC级）均产自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM培养基产自美国HyClone公司；甲氧基聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-2000（mPEG-DSPE2000）产自美国 Laysan Bio公司；蛋黄卵磷脂（EPC）产自上海东尚公司。

二、方法

1.药物配制：

（1）4-HPR 溶液：20 μg 4-HPR 加入 200 μl 0.04%的二甲基亚砜（DMSO）溶解，-20℃长期保存，实验时用DMEM培养液稀释至相应浓度。

（2）4-HPR脂质体：EPC 28 mg、胆固醇2.5 mg、mPEG-DSPE2000 3 mg、4-HPR 3 mg，加入适量氯仿，涡旋、转蒸得到淡黄色膜状物，加入4 ml去离子水水浴水化，静置后得到载4-HPR脂质体混悬液，水膜过滤得4-HPR脂质体溶液［3］。

（3）4-HPR微泡：取4-HPR脂质体溶液1 ml，加入10 μl全氟戊烷，冷水浴内超声60 s，得4-HPR微泡溶液。置于4℃冰箱内密封保存，30 d内保存过程中，观察外观变化。

2.细胞增殖实验（MTT法）：

（1）不同浓度4-HPR脂质体溶液对细胞增殖的影响：采用MTT比色法检测。将HKF以4 000个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24 h后，弃去旧培养液，分别向各孔内加入4-HPR脂质体溶液，使药物终浓度分别为0、1、2.5、5、10、20、40和80 mg/L，同时设空白组（不加细胞），继续培养6、12、24、48 h后取出培养板，每孔加入（避光条件下）5 g/L的MTT溶液 20 μl，置 CO2培养箱内避光孵育 4 h，加 DMSO 150 μl，振荡10 min，置酶标仪490 nm波长下检测各孔吸光度（A）。细胞增殖抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）× 100%。

（2）超声及不同载体中HRP对细胞增殖的影响：细胞接种实验如同前操作，细胞分为3组，分别用含15 mg/L 4-HPR溶液、4-HPR脂质体溶液和4-HPR微泡的含药培养液培养24 h，每组再分为2个亚组，超声亚组给药后立即进行超声，另一亚组则不予超声处理。超声方法为在培养皿底部涂层超声耦合剂，利用低强度聚焦超声仪以频率3 MHz，功率 1 W/cm2，刺激周期 20%，超声 30 s［4］。设对照组，仅加入细胞，但不给药，其他处理同上。MTT法检测细胞增殖情况，具体方法同上。

3.流式细胞仪检测细胞凋亡率：将HKF以1×105个/孔接种入6孔培养板内培养48 h。实验分为对照组、4-HPR脂质体组、4-HPR微泡组：4-HPR脂质体组和4-HPR微泡组分别加入15 mg/L 4-HPR脂质体和微泡，对照组则加入含等体积5%葡萄糖的培养基。继续培养24 h后，收集各组细胞，冷PBS洗涤2次，加入结合液400 μl悬浮细胞，再加入5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素染色液，混匀后4℃避光孵育15 min，再加10 μl碘化丙锭染色液，混匀，4 ℃孵育（避光）5 min后，收集细胞立即用流式细胞仪检测。

4.统计学方法：所有数据以Excel记录，计量资料用±s表示，用SPSS17.0软件进行统计学处理，细胞增殖抑制率比较采用重复测量的方差分析，组间比较采用Bonferroni法，药物浓度与细胞增殖抑制率的关系采用Pearson相关分析，对成纤维细胞凋亡的影响采用独立样本T检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。。

结 果

一、不同载体药物形态学观察

4-HPR脂质体溶液及4-HPR微泡溶液在外观上未见明显区别，均呈现为略带蓝色乳光的淡黄色澄清液体。在透射电镜下观察4-HPR脂质体溶液及4-HPR微泡溶液均呈球形或类球形结构，大小均匀、外观圆整（图1）。两种溶液置于4℃冰箱内密封保存，30 d保存过程中，一直为淡黄色澄清液体，说明制备药物稳定性良好，可用于下一步实验。

二、4-HPR脂质体溶液对HKF增殖的影响

1～80 mg/L 4-HPR脂质体溶液作用24 h对HKF增殖有抑制作用，抑制率和药物浓度呈正相关（r=1.158，P＜ 0.001）。见图2。半数抑制浓度（IC50）估计值为15.01 mg/L，95%置信区间为13.10～17.02 mg/L。重复测量的方差分析显示，增加溶液浓度或者延长作用时间均能使细胞增殖抑制率增加（F值分别为5.45、11.26，P值均 ＜ 0.001），并且药物浓度和作用时间表现为两个相对独立的因素，彼此之间交互作用不显著（F=0.217，P=0.685）。

三、4-HPR溶液、4-HPR脂质体和4-HPR微泡联合超声对HKF增殖的影响

图1 透射电镜观察4-HPR脂质体（1A）和4-HPR微泡（1B）

图2 不同浓度4-羟苯基维胺作用不同时间对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 2A：增殖抑制率随时间的变化曲线；2B：增殖抑制率随药物浓度的变化曲线

在不超声的情况下，4-HPR溶液对HKF的抑制作用大于4-HPR微泡和4-HPR脂质体，而4-HPR微泡和4-HPR脂质体的抑制作用相当。超声处理后，4-HPR微泡对HKF的抑制率显著增加（t=9.440，P=0.001），4-HPR溶液和4-HPR脂质体的抑制作用也明显增强；对照组联合超声对HKF的增殖抑制率约为10%，见表1。

四、4-HPR对HKF凋亡的影响

4-HPR脂质体组和4-HPR微泡组HKF凋亡率分别为（21.81±3.73）%和（39.79±1.61）%，较对照组（6.18±0.61）%均显著增加（t值分别为16.59、52.12，均P＜ 0.01）。见图3。

讨 论

由于4-HPR的水溶性较差，在制备4-HPR脂质体的过程中，载体与药物的比例要适当，使所投的载体能包裹药物，尽量降低游离药物的量。本研究选择氯仿作为溶剂溶解4-HPR、PEG-DSPE和EPC，得到澄清的溶液，未见沉淀，溶解良好，旋蒸后成膜均匀。在4-HPR脂质体中加入全氟戊烷超声后得到4-HPR微泡，稳定性增强，全氟戊烷能够很好地包裹在脂质体内部。

表1 各组药物在有或无超声处理时对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制率（%，±s）

表1 各组药物在有或无超声处理时对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制率（%，±s）

注：n=5。a：与对照组比较，P ＜ 0.01；b：与4-HPR溶液组比较，P＜0.05或＜0.01；c：与4-HPR脂质体组比较，P＜0.01

分组对照组4-HPR溶液组4-HPR脂质体组4-HPR微泡组F值P值P值＜0.001 0.007 0.036 0.001 t值8.660 5.080 2.550 9.440非超声处理0 44.00±4.58a 30.33±1.53ab 34.33±5.86ab 25.063＜0.001超声处理10.00±2.00 59.33±2.52a 34.67±1.52ab 73.00±4.00abc 29.394＜0.001----

图3 流式细胞仪观察不同载体中4-HPR对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响 3A：对照组；3B：4-HPR脂质体组；3C：4-HPR微泡组

大量研究表明，4-HPR在体外实验中可引起多种肿瘤细胞的凋亡［5］。4-HPR主要通过维A酸受体（RAR）和非RAR途径抑制细胞生长及诱导肿瘤细胞凋亡，但具体作用机理尚未明确，目前认为主要是通过提高活性氧、神经酰胺的水平，刺激半胱天冬酶活性增加等机制来诱导肿瘤细胞凋亡［6］。

本研究显示，4-HPR对HKF增殖的抑制作用具有浓度、外界条件依赖性。在药物浓度相同的情况下，4-HPR溶液对HKF的抑制作用明显强于4-HPR微泡和4-HPR脂质体，可能是因为4-HPR溶液中药物直接暴露于单层贴壁细胞，而4-HPR脂质体与4-HPR微泡在细胞培养过程中脂质体结构逐渐分解缓慢释药，所以作用较4-HPR溶液缓慢。而且，超声处理后4-HPR溶液组和4-HPR脂质体组细胞抑制率相对于未经超生处理时有明显升高，表明超声波对药物的释放和吸收有促进作用；4-HPR微泡组由于超声的作用，微泡破碎，对细胞的抑制作用显著大于4-HPR溶液组、4-HPR脂质体组；对照组超声处理后对细胞具有一定的增殖抑制，说明超声不仅对纳米粒的释药和药物吸收有促进作用，对HKF的增殖也有抑制作用。

细胞凋亡实验显示，在同等强度超声作用下，4-HPR脂质体组和4-HPR微泡组HKF凋亡率与对照组相比均明显增高，其中4-HPR微泡组最为显著，说明4-HPR微泡联合超声能更有效地诱导HKF凋亡。

综上，我们认为4-HPR可以有效抑制HKF增殖，诱导其发生凋亡，且4-HPR微泡联合超声较4-HPR溶液、4-HPR脂质体溶液能更有效地抑制HKF增殖并诱导其凋亡，为临床上更好地治疗瘢痕疙瘩提供理论和实验依据。

［1］Huang C,Ogawa R.Pharmacological treatment for keloids［J］.Expert Opin Pharmacother,2013,14（15）:2087-2100.DOI:10.1517/14656566.2013.826651.

［2］Sogno I,Venè R,Ferrari N,et al.Angioprevention with fenretinide:targeting angiogenesis in prevention and therapeutic strategies［J］.Crit Rev Oncol Hematol,2010,75（1）:2-14.DOI:10.1016/j.critrevonc.2009.10.007.

［3］Badaoui FZ,张灿.载药聚合物胶束的制备和肿瘤靶向性研究进展［J］.北方药学,2013,10（6）:61-62,63.

［4］Rapoport NY,Nam KH,Gao Z,et al.Application of ultrasound for targeted nanotherapy of malignant tumors［J］.Acoust Phys,2009,55（4-5）:594-601.DOI:10.1134/S1063771009040162.

［5］Vratilova J,Frgala T,Maurer BJ,et al.Liquid chromatography method for quantifying N-（4-hydroxyphenyl）retinamide and N-（4-methoxyphenyl）retinamide in tissues［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,808（2）:125-130.DOI:10.1016/j.jchromb.2004.02.031.

［6］Gao ZG,Fain HD,Rapoport N.Controlled and targeted tumor chemotherapy by micellar-encapsulated drug and ultrasound［J］.J Control Release,2005,102（1）:203-222.DOI:10.1016/j.jconrel.2004.09.021.

Effects of 4-hydroxyphenyl retinamide in different vehicles on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts

Li Zhouna,Chen Xiangru,Jin Zhehu
Department of Dermatology,Yanbian University Hospital,Yanji 133000,Jilin,China

Jin Zhehu,Email:jinzh_621@163.com

ObjectiveTo evaluate effects of 4-hydroxyphenyl retinamide（4-HPR）in different vehicles on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts（HKFs）.MethodsA filmultrasonic dispersion method was used to prepare 4-HPR liposome solution and 4-HPR microbubbles.Primary HKFs werein vitrotreated with the 4-HPR liposome solution at different concentrations of 0-80 mg/L for 6-48 hours,and the proliferative activity of HKFs was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.Some other HKFs were divided into 3 experimental groups to be treated with 15 mg/L 4-HPR solution（4-HPR solution group）,15 mg/L 4-HPR liposome solution（4-HPR liposome solution group）and 15 mg/L 4-HPR microbubbles（4-HPR microbubble group）,respectively,and each group was divided into ultrasonic-treated and-untreated subgroups.HKFs without treatment served as control group.After 24-hour treatment,MTT assay was conducted to evaluate the proliferative activity of HKFs in the above groups,flow cytometry to detect apoptosis of HKFs in all groups except the 4-HPR solution group.ResultsThe 4-HPR liposome solution and 4-HPR microbubbles were successfully prepared.MTT assay showed inhibitory effects of 4-HPR liposome solution at concentrations of 1-80 mg/L on the proliferation of HKFs,and the proliferation inhibition rate was positively associated with the drug concentrations（r=0.633,P＜ 0.01）.After the ultrasonic treatment,inhibitory effects on the proliferation of HKFs significantly differed among the 4-HPR microbubble group,4-HPR solution group and 4-HPR liposome solution group（P＜ 0.01）.The 4-HPR liposome solution group and the 4-HPR microbubble group both showed significantly increased apoptosis rates（21.81% ±3.73%,39.79% ±1.61%,respectively）compared with the control group（6.18% ± 0.61%,bothP＜ 0.01）.ConclusionThe 4-HPR microbubbles are successfully prepared,and 4-HPR in different vehicles all can promote HKF apoptosis and suppress HKF proliferation,among which,4-HPR microbubbles in combination with ultrasonic treatment have stronger inhibitory effects than the 4-HPR liposome solution.

Tretinoin;Keloid;Fibroblasts;Cell proliferation;4-Hydroxyphenyl-retinamide

金哲虎，Email：jinzh_621@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.010

国家自然科学基金（81260233）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目［吉教科合字（2012）第2号］；吉林省卫生厅科研课题（2011Z085）；吉林省产业技术研究与开发专项（2013C034）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81260233）;Science and Technology Research Project of the Education Department of Jilin Province during the 12th Five-Year Plan Period［（2012）2］;Research Foundation of Health Department of Jilin Province of China（2011Z085）;Research and Development Planning Project of Industries and Technology of Jilin Province of China（2013C034）

2016-12-02）

（本文编辑：尚淑贤）