261例G6PD缺乏症患儿基因突变型与血型关系的探讨

谭忠友，余超

(重庆三峡中心医院妇儿医院儿内一科，重庆 万州 404000)

261例G6PD缺乏症患儿基因突变型与血型关系的探讨

谭忠友，余超

(重庆三峡中心医院妇儿医院儿内一科，重庆 万州 404000)

目的初步探讨ABO血型与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenas，G6PD)缺乏症基因突变型的交互作用及分析。方法从G6PD缺乏症患者中，运用二代测序技术筛选出G1388A、G1376T、A95G点突变的患者；血清学方法检测血型。应用SPSS 21.0软件对结果进行比较分析。结果355例缺乏症患者中检出261例基因突变，突变检出率为73.5%；且基因突变型在ABO血型的血型分布上有显著差异(P<0.05)，具有相关性。结论ABO血型与G6PD缺乏症基因突变型之间存在交互关系。

ABO血型；G6PD缺乏症；基因突变

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenas，G6PD)缺乏症是一种红细胞酶缺陷疾病，也是最常见的遗传性血液病之一[1]。本课题组在前期研究的基础上[2]，从重庆市万州区三峡中心医院355例G6PD缺乏症患者中利用二代测序技术，筛选了G6PD缺陷并伴有点突变型的261例患者病例，并首次通过血型分组对G6PD缺乏症患者血型与基因突变型之间的相互关系进行分析，同时也初步探索了ABO血型与G6PD基因突变型间的潜在关联；为进一步明确这种疾病的发病机制及预防提供新的思路。

1 材料与方法

1.1一般资料

收集重庆三峡中心医院从2009年7月至2013年7月收治的G6PD缺乏症的355例诊断符合《血液病诊断与疗效标准》[3]的患儿基本资料。二代测序技术二次筛选出G6PD缺乏症并伴有3种已知突变，即G1388A,G1376T,A95G，共计261例患儿，且排除其他疾病者。常规ABO血型检测方法测定ABO血型。所有检测均严格按照说明书进行。所有患儿均使用外周静脉血2～3 mL，并采用EDTA-K3抗凝，4 ℃保存备用。抗凝全血加入G6PD和6PGD反应液，混匀置于37 ℃进行水浴，20 min后终止反应。全自动生化测定仪进行吸光度值测量，得到G6PD和6PGD各自的值，并计算比值。G6PD缺乏症诊断标准：G6PD/6PGD<1.0。将261例伴G1388A,G1376T,A95G突变型的患者根据ABO血型的不同，分为A、B、O、AB4组。所有患儿均通过临床检查和实验室检查。本次研究与检测均通过医院伦理委员会批准，并获得患儿法定监护人的知情同意书。

1.2第二代基因测序技术

针对G6PD全外显子上下游50 bp，采用Primer 5.0设计进行引物设计样本首先按照Lahiri法[4]进行DNA制备，并用PCR检测1 388G→A,1 376G→T,95A→G突变。本次实验采用20 μL 反应体系，其中模板DNA1 μL， 两对引物各200 nmol/L，2×TaqMan Universal PCRMaster Mix10 μL。热循环条件为：95 ℃ 4 min，然后95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循环30次，72 ℃ 7 min。取PCR产物8 μL与溴酚蓝染液1 μL混合，产物用2.5%的琼脂糖凝胶(琼脂糖含有浓度为2%的Gelred 的染料)电泳(100 V，20～45 min)进行分析，并在紫外成像仪下显色,在ABI PRISM 377型测序仪分析测序结果进行测序分析。具体技术操作由上海凡迪生物有限公司进行操作。

1.3 ABO血型鉴定

使用采集的EDTA-K2抗凝全血2 mL，按检验操作步骤即生理盐水稀释并取适量的红细胞悬液滴于盛有A型或B型标准血清的血型卡和玻璃试管中混匀，在室温下放置15～30 min后，在低倍镜下观察有无凝集现象。

1.4统计学分析

测序结果用生物信息学软件Splice View进行突变分析，并运用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析，G6PD缺乏症基因突变型与ABO血型的关系运用χ2检验，P<0.05，即表达差异具有统计学意义。

2 结果

在此次筛查的355例G6PD缺乏症患儿中(年龄为1～166个月，男性336例，女性19例，汉族352例，苗族1例，土家族2例)，其中有261例G6PD缺乏症患儿在利用突变特异性扩增系统(ARMs)筛查被发现存在G1388A、G1376T、A95G261基因突变型，突变检出率约73.5%。而在这261例G6PD缺乏症伴有基因突变型的患儿中，男248例,女13例,男女比例为19.07∶1； 伴有G1388A突变型有127例(48.7%),G1376T突变型有99例(37.9%),A95G35例(13.4%)。此外，从结果中研究者首次观察到，在261例G6PD缺乏症且伴有基因突变的患儿中,A型血患儿存在突变者占88例(33.7%)，B型患儿存在血突变者为60例(23.0%)，AB型血患儿存在突变者有23例(8.8%)； O型血的患儿存在突变者90例(34.5%)，以O型血基因突变型占的比率最多。此外，结果还显示261例G6PD缺乏症并伴有基因突变型患者在ABO血型的血型分布上有显著差异(P<0.05)，具有相关性(表1)。

表1 261 例G6PD缺乏症基因突变型患者ABO血型分布比较

注：G6PD缺乏症并伴有基因突变型患者与ABO血型分布的关系，用相关性交叉表和卡方检验，P=0.045。

3 讨论

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是一种潜在、致病的遗传酶异常；它本身是1种广泛表达的酶，在多种细胞中担任“管家”的角色，尤其在红细胞(RBCs)中，对其完整性和功能性尤为关键[5]。G6PD缺乏会选择性影响RBCs，导致的红细胞酶性改变；以致不能够抵御氧化损伤而遭受破坏而引起的溶血性贫血[6]。全世界迄今已报道了370种以上的G6PD变异型，而在中国人群已经被鉴定出的31种点突变中，以G1388A、G1376T和A95G为最多的突变类型[2,7]。题组在前期回顾性的调查了重庆地区G6PD缺乏症患儿的临床资料，并对其诱因、发病机制、临床表现、实验室检查、治疗及预后进行分析[8]。结果显示，重庆地区G6PD缺乏症以点突变G1388A占38.6%(125/355)，G1376T占31.2%(101/355)，A95G占10.8%(35/355)为3种最为主要的突变型。有报道，此三基因突变型的患者G6PD活性仅为正常人的5%～18%[9]。

目前存在多种诊断G6PD缺乏的方法,尽管G6PD活性检测是1种较为常用的定量检测方法,但利用检测G6PD和6PGD活性之定量比值与G6PD进行临床诊断的高准确率会大大提高。因此在此次试验中，研究者首先根据G6PD缺乏症诊断标准：G6PD/6PGD<1.0，将比值在此范围内的患儿纳入后期的检测对象。

血型是人类重要的遗传表型，常见的有ABO血型系统，Rh血型系统，MN血型系统等[10]。其中，对于ABO血型的研究源于上世纪，它是人类最常见和比较容易获得的一种稳定性遗传特征之一，通过对它的研究对于某些疾病遗传倾向及易感性的了解都具有重要意义[9-10]。关于ABO血型系统的分子研究源于上世纪90年代，它是第一个被描述的红细胞血型系统,也是最具有临床意义的一个系统[10]。1974年，Lesho等[11]在研究G6PD缺陷是否与ABO血型存在相关性时，就发现在非洲和亚洲人群中，O型血的发病率较高，但没有足够的数据显示G6PD缺陷与ABO血型分布之间存在相关性。近来，通过血型和疾病的关联来诠释一种疾病的机制，逐渐再次成为遗传医学领域中的热点和手段。许多疾病的潜在机制，都是在遗传学的研究中得以突破。对于血型的研究有助于对先天性、家族性、自身免疫性以及不明原因疾病的遗传倾向或者易感性有深入的了解。G6PD缺乏症本身是一种遗传性红细胞酶缺陷病；随着分子生物及测序技术的发展，使研究者对于G6PD缺陷基因突变的多态性及遗传分布有了更进一步的了解，这些都有助于对G6PD缺乏症的潜在机制寻找新的证据;所以在前期大量的筛查工作之后，研究者首次探索了G6PD缺乏症基因突变与血型分布的关联趋势以及分布特点。在本次试验中，研究者从355例临床诊断为G6PD缺乏症的患儿中，筛选出伴有G1388A,G1376T,A95G突变的261例 ,通过临床检查和实验室检查,将这些患者根据ABO血型,分为A、B、O、AB四组进行统计分析。结果显示，261例G6PD缺乏症并存在G1388A、G1376T、A95G基因突变的患儿中,男性患儿显著多于女性，这与刘丽红等[12]研究结果一致。此外,在男、女性G6PD缺乏症伴有基因突变的患者中均为O型血最多，A型血其次，表明O型血G6PD缺乏症的患儿可能存在基因突变可能性和潜在风险更大，这对临床诊断G6PD缺乏症患儿有一定指导作用。至于O性患者G6PD突变频率较高的机理目前尚不清楚，目前国内外文献未发现有相关报道。李锡福等[13]在一项关于G6PD缺乏与新生儿性别和血型关系的研究中发现，O型血的新生儿G6PD缺乏显著多于其它血型的新生儿,这与此次结果是一致的。与李等的研究所不同的是，此次研究中首次将我国主要的基因突变型纳入分析，结果发现血型因素与G6PD缺陷基因突变型之间存在关联。

G6PD缺乏症临床上主要的急性表现为溶血性贫血及高胆红素血症，不仅会影响智力发育，严重者还可发生黄疸甚至导致死亡。对于G6PD缺乏症的研究目标主要在于早期干预，防止急性症状的发生。本研究在确诊G6PD缺乏症的患儿中，筛选了伴有基因突变型的病例，进行与血型的交互关系分析，结果对G6PD缺乏症的预防及易感因素都提供了新的信息。

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Investigationofrelationshipbetweenmutationgenotypeandbloodgroupin261patientswithglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency

TAN Zhong-you,YU Chao

(DepartmentofInternalMedicine,WomenandChildren’sHospitalofChongqingThreeGorgesCentralHospital,Wanzhou404000,Chongqing,China)

Objective：To study the interaction between mutation genotype and ABO blood group in 261 patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.MethodsThe second generation sequencing technology was used to identify 261 patients with G6PD deficiency and G1388A、G1376T、A95G mutations.Blood groups were detected with serological method.The interaction effect between blood group and gene mutation was analyzed by SPSS 21.0.ResultsMutations occurred in 261 of 355 patients with G6PD deficiency,the mutation rate was 73.5%.There was a significant difference the blood type distribution of ABO blood group and gene mutation (P<0.05).ConclusionThere is synergistic action between ABO blood group and mutation genotype in G6PD deficiency.

ABO blood group；G-6-PD deficiency；Gene mutation.

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.018

重庆市万州区科研基金资助项目(201403019)

2017-06-03

谭忠友(1975-)，男，副主任医师。

余超,E-mail：442809156@qq.com

时间： 2017-10-10 02∶28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.038.html

1005-3697(2017)05-0712-03

R722.1

A

(学术编辑刘云)

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