吸烟对HDL-C正常者的胆固醇外流功能影响的研究

邓晓剑，顾建华，何顶秀，黄楷森

(1.德阳市人民医院·成都中医药大学德阳临床医学院，1.心内科；2.神外科；3.急诊科，四川 德阳 618000)

吸烟对HDL-C正常者的胆固醇外流功能影响的研究

邓晓剑1，顾建华2，何顶秀3，黄楷森1

(1.德阳市人民医院·成都中医药大学德阳临床医学院，1.心内科；2.神外科；3.急诊科，四川 德阳 618000)

目的通过对比吸烟和不吸烟者外周血中高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)相关的巨噬细胞胆固醇外流功能，以明确吸烟对于胆固醇逆向转运过程的影响。方法分别纳入42名高密度脂蛋白胆固醇正常的吸烟者和不吸烟者为研究对象，使用胆固醇外流荧光分析法，测量研究对象外周血血浆中的HDL对J774A.1巨噬细胞外流率的影响。结果两组研究对象在一般情况、血脂谱和高敏C反应蛋白基本一致情况下，吸烟组巨噬细胞胆固醇外流率显著低于不吸烟组，差异具有统计学意义[(25.72±7.36)%vs. (29.53±7.97)%,P<0.05]，提示吸烟可影响HDL相关的胆固醇外流功能。结论吸烟者HDL相关的胆固醇外流率显著低于不吸烟者，表明吸烟者体内HDL的抗动脉粥样硬化功能受到明显削弱，提示戒烟在心血管疾病一级预防中的重要性。

吸烟；高密度脂蛋白，胆固醇外流率

心血管疾病自1990年起持续为我国居民首位死因，其中75%以上的心血管疾病是动脉粥样硬化性疾病。而在动脉粥样硬化性疾病中，31.9%的发病危险度归因于吸烟，仅次于高血压[1]。在动脉粥样硬化形成的病理生理过程中，脂质异常被认为是中心环节之一[2]。既往大量研究证实了吸烟可通过升高低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)，降低高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)，促进LDL的氧化修饰等多种机制促进胆固醇在动脉内膜下异常沉积，从而导致动脉粥样硬化形成[3-4]。然而，吸烟是否可作用于HDL相关的胆固醇逆向转运过程目前仍少有研究。因此，本研究通过测定吸烟患者HDL相关的巨噬细胞胆固醇外流功能，以明确吸烟对于胆固醇逆向转运过程是否存在影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1研究对象

纳入2015年11月至2015年12月在德阳市人民医院体检中心的42名明确吸烟指数(smoking index，SI)≥400，且HDL-C正常者为吸烟组。同时，根据吸烟组患者性别和年龄(±1岁)进行配对，纳入42名否认吸烟史，且HDL-C42正常者为不吸烟组。两组患者一般资料见表1。 两组患者在BMI、心率、收缩压以及舒张压等方面差异均无统计学意义(P>0.05),提示两组患者一般情况具有可比性。研究方案经医院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。排除标准：(1)年龄<18岁或孕产妇；(2)合并糖尿病、冠心病、心衰、脑卒中、严重肝肾疾病、肿瘤或免疫系统疾病患者；(3)合并任何类型的现症感染；(4)合并严重心理精神疾病；(5)拒绝签署知情同意书。

表1 吸烟组与不吸烟组一般情况比较

注：两组间比较采用 Paired-SamplesT检验。

1.2测量指标

采集患者空腹外周静脉血30 mL，常规方法测定总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、LDL-C、HDL-C，载脂蛋白(apolipoprotein,Apo)AⅠ和B，脂蛋白(lipoprotein,LP)a以及高敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hsCRP)，同时制备外周静脉血血浆以测定胆固醇外流。

1.3主要材料与试剂

J774A.1巨噬细胞株(普诺赛)，胆固醇外流分析试剂盒-荧光法(Biovision)，RPMI 1640培养基(普诺赛)和胎牛血清FBS(普诺赛)，96孔板(塞默飞世尔)，荧光分光光度计(日立F-4600 型)。其余试剂均为国产分析纯。

1.4胆固醇外流率测定

将J774.1细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养直至90%融合状态(37℃孵育，5%CO2)。在无菌条件下将细胞转移至96孔板，平均每孔含细胞约1×105个及100μL培养液。生长2 h后，当细胞附着于孔板，用RPMI 1640洗涤细胞。每孔添加含50μL标记液后培养板过夜(约16 h)后，移除标记液，再次洗涤细胞。将处理后的患者血清加入J774.1细胞至每孔100μL，孵育约4～6 h。在孵育结束时，将上清液转移到96孔板，测量细胞外流液荧光值。在剩下细胞中加入裂解液100μL，充分裂解后再次测量细胞裂解液荧光值。胆固醇外流率计算公式为：胆固醇外流率(%)=100%×细胞外流液荧光强度/(细胞外流液荧光强度+细胞裂解液荧光强度)。

1.5统计学分析

2 结果

2.1血脂及hsCRP比较

两组患者空腹血中CHOL、TG、LDL-C、HDL-C、Apo AⅠ、ApoB、LP(a)及hsCRP水平差异均无统计学意义(表2)，且均在正常值范围之内。

指标吸烟组不吸烟组P值TC(mmol/L)4.21±0.764.04±0.920.437TG(mmol/L)1.76±1.051.80±0.960.867HDL-C(mmol/L)1.34±0.441.34±0.440.977LDL-C(mmol/L)2.33±0.702.11±0.660.139Apo-AⅠ(g/L)1.33±0.221.25±0.270.203Apo-B(g/L)1.25±0.281.20±0.350.507LP(a)(mg/L)223.58±92.73208.56±89.040.452hsCRP(mg/L)2.64±0.642.49±0.600.242

*两组间比较采用 Paired-Samples T 检验。

2.2胆固醇外流率比较

由吸烟组与不吸烟组外周空腹血血浆中HDL所介导的，J774A.1小鼠单核巨噬的胆固醇外流率分别为(25.72±7.36)%和(29.53±7.97%)，见图1，差异具有统计学意义(P﹤0.05)。

*P<0.05，与吸烟组比较。

3 讨论

本研究通过对比吸烟组与不吸烟组患者外周血血清中HDL，对于J774A.1巨噬细胞胆固醇外流率的影响，发现在两组患者在一般情况、脂质谱和hsCRP基本一致情况下，吸烟组巨噬细胞胆固醇外流率显著低于不吸烟组。提示吸烟降低患者HDL介导巨噬细胞胆固醇外流率，是HDL的抗动脉粥样硬化功能失效的可能机制。

损伤-反应学说认为，内皮细胞损伤后，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和胆固醇大量沉积。由单核细胞迁移、转化而来的巨噬细胞在内皮下大量吞噬脂质后成为泡沫细胞，并于内皮下其他成分相互作用逐渐形成动脉粥样硬化病变。与此同时，HDL作为动脉粥样硬化的保护因素，可以作为胆固醇的接受体，介导胆固醇从巨噬细胞流出并转运之到肝脏进行代谢，从而降低胆固醇水平，预防动脉粥样硬化的发生[5]。目前主要通过测定其中的胆固醇成分对HDL进行间接定量测定。既往研究发现吸烟可导致HDL-C水平降低。Craig等[6]回顾了54项研究，发现吸烟者血浆中HDL-C水平较不吸烟者相比平均低6%。Forey等[7]所做的系统评价表明，HDL-C水平在戒烟前后差值为0.06～0.11 mmol/L。大量研究关注吸烟与HDL-C水平关系的同时，仅有极少数研究涉及了吸烟与HDL功能之间的关系，如Kralova等[8]发现不吸烟的中年女性HDL所介导的胆固醇外流率较吸烟者显著增加。

本研究选择HDL-C正常者为研究对象，可部分排除HDL水平高低不同对于胆固醇外流率的影响。同时，本研究在测量胆固醇外流率时使用巨噬细胞，而非研究对象自身来源巨噬细胞，故此时的胆固醇外流率主要反映研究对象体内HDL对于胆固醇逆转运过程的影响。结果提示吸烟组巨噬细胞胆固醇外流率显著低于不吸烟组，与既往类似研究结果一致[8]。本研究在检测胆固醇外流率过程时，采用了荧光标记的胆固醇，而非既往研究常用的放射性同位素标记。这种新的检测方法[9]，可有效避免放射性同位素的辐射效应，同时显著降低了检测成本，适用大样本量的检测。

吸烟是动脉粥样硬化疾病的重要致病因素，同时也几乎是惟一能够完全逆转致病因素。大量流行病学调查和前瞻性临床研究结果均证实吸烟与心血管疾病存在因果关系。戒烟治疗的花费用远远低于药物治疗的费用，因此戒烟是避免心血管病死亡最经济、有效的干预措施。同时也是心血管疾病一级预防的主要措施[1]。既往大量研究证实吸烟可导致氧化应激，血管炎症，血小板聚集，内皮功能紊乱以及血脂谱异常[3]，本研究发现在未合并明确心血管疾病的长期重度吸烟者，体内HDL介导的巨噬细胞胆固醇外流率显著降低，HDL的抗动脉粥样硬化功能受到明显削弱。本研究结果再次强调了戒烟在心血管疾病一级预防中的重要地位，以及通过行为治疗、心理社会支持以及戒烟药物治疗等多种方式提高戒烟成功率的重要性。

[1] 中国医师协会心血管内科医师分会《中华内科杂志》编辑委员会.心血管疾病一级预防中国专家共识[J].中华内科杂志,2010，49(2)：174-185.

[2] Stone NJ,Robinson JG,Lichtenstein AH,etal.2013 ACC/AHA guideline on the treatment of blood cholesterol to reduce atherosclerotic cardiovascular risk in adults:a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J].Circulation,2014,129(Suppl 2):S1-S45.

[3] Siasos G,Tsigkou V,Kokkou E,etal.Smoking and atherosclerosis:mechanisms of disease and new therapeutic approaches[J].Current medicinal chemistry,2014,21(34):3936-3948.

[4] Escola-Gil JC,Julve J,Griffin BA,etal.HDL and lifestyle interventions[J].Handbook of experimental pharmacology,2015,224(224):569-592.

[5] Goldschmidt-Clermont PJ,Dong C,Seo DM,etal.Atherosclerosis,inflammation,genetics,and stem cells:2012 update[J].Current atherosclerosis reports,Jun,2012,14(3):201-210.

[6] Craig WY,Palomaki GE,Haddow JE.Cigarette smoking and serum lipid and lipoprotein concentrations:an analysis of published data[J].BMJ,1989,298(6676):784-788.

[7] Forey BA,Fry JS,Lee PN,etal.The effect of quitting smoking on HDL-cholesterol-a review based on within-subject changes[J].Biomarker research,2013,1(1):26.

[8] Kralova Lesna I,Poledne R,Pagacova L,etal.HDL and apolipoprotein A1 concentrations as markers of cholesterol efflux in middle-aged women:interaction with smoking[J].Neuro endocrinology letters,2012,33(Suppl 2):38-42.

[9] Ormseth MJ,Yancey PG,Solus JF,etal.Effect of drug therapy on net cholesterol efflux capacity of HDL-enriched serum in rheumatoid arthritis[J].Arthritis & rheumatology,2016,68(9):2099-2105.

StudytheeffectsofsmokingoncholesteroleffluxfunctioninhealthysubjectswithnormalHDL-C

Deng Xiao-jian1,Gu Jian-hua2,He Ding-xiu3,Huang Kai-sen1

(1.DepartmentofCardiology;2.DepartmentofCerebralSurgery;3.DepartmentofEmergency,People’sHospitalofDeyangCity,ChengduUniversityofTCM,Deyang618000,Sichuan,China)

Objective：To investigate and compare the HDL related cholesterol efflux capabilities between smokers and non-smokers without arteriosclerotic cardiovascular disease,and to determine the effects of smoking on reverse cholesterol transport.Methods42 smoking patients with normal HDL in smoking group and 42 non-smoking patients in control group were included.The effect of HDL in peripheral blood plasma on the efflux rate of J774A.1 macrophages was measured by cholesterol efflux fluorescence analysis.ResultsThe capability of HDL to activate cholesterol efflux was shown to reduce significantly in smoking group,compared with non-smoking group(25.72±7.36%vs.29.53±7.97% ).the two groups of subjects in the general situation,blood lipid spectrum and high sensitivity C reactive protein basically the same situation,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionHDL related cholesterol efflux rate in smokers was significantly lower than that of non-smokers,smokers showed that HDL anti atherosclerosis function is obviously weakened,suggesting the importance of smoking cessation in the primary prevention of cardiovascular diseases.

Smoking;High-density lipoprotein;Cholesterol efflux

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.022

四川省医学会青年创新课题(Q16027、Q15064)

2017-05-10

邓晓剑(1968-)，男，副主任医师。E-mail：hushijie2004@sina.com

黄楷森，E-mail：271388479@qq.com

时间： 2017-10-10 02∶28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.046.html

1005-3697(2017)05-0725-03

R541.4

A

(学术编辑罗勇)

本刊网址：http：//www.nsmc.edu.cn作者投稿系统http：//noth.cbpt.cnki.net邮箱xuebao@nsmc.edu.cn