石油烃对水生动物的影响及其检测方法

罗龙娟，张勇，王海宇

(广州市海洋与渔业环境监测中心， 广州501235)

石油烃对水生动物的影响及其检测方法

罗龙娟，张勇*，王海宇

(广州市海洋与渔业环境监测中心， 广州501235)

石油污染事故导致石油烃成为近海中最主要的污染物之一，大量的石油烃进入水体对水生动物造成了严重的危害。有效的测定方法能及时监测水生动物中石油烃的含量，对石油污染事故及时做出应对措施。文章就石油烃的种类、对水生动物的影响以及石油烃和多环芳烃的检测方法方面进行了梳理，以期能够对相关工作提供借鉴和参考。[中国渔业质量与标准，2017,7(5):18-24]

石油烃；水生动物；危害；检测方法

近年来，中国石油需求量逐年提高，国内石油产量远不能满足需求。自1993年中国已成为石油净进口国，并且进口量逐年增加。海上运输是石油运输的主要途径[1]，致使海上溢油的风险进一步加大。国内发生过数起海上溢油事件：2010年大连新港输油管爆炸溢油事件、2011年蓬莱19-3油田溢油事故、2012年“雅典娜”号化学船沉没事故以及2013年青岛东黄输油管线爆燃事故[2]，引起了人们对石油烃污染的关注。

海上溢油导致大量的石油烃进入海洋，水生动物是海洋生态系统中的重要组成部分，以水生动物为载体来研究石油烃的影响，完善石油烃和多环芳烃的检测方法，有助于更好地掌控石油烃对海洋环境的影响，及时对海洋石油烃污染事件做出应对措施。目前，石油烃的研究主要集中在某一海域石油烃的分布状况[3-5]、水生动物对石油烃的富集动力学研究[6-8]以及石油烃降解菌筛选[9-11]等方面。为丰富石油烃对水生动物的影响及检测方法的相关研究，本文对石油烃的种类、石油烃对水生动物的影响以及检测方法进行综述，旨在为相关研究提供借鉴和参考。

1 石油烃的种类

石油烃由烃类物质和非烃类物质两部分构成，其中烃类物质为主体，约占80%～90%。烃类物质主要包括烷烃(约占25%～35%)、环烷烃(约占40%～50%)、芳香烃(约占5%～10%)和环烷芳烃(约占5%～10%)，具体构成如图1[12]所示。

图1 石油烃的种类Fig.1 Types of petroleum hydrocarbons

2 石油烃对水生动物的影响

当海洋中石油烃含量达到一定浓度时，会引起水生动物DNA甲基化水平的变化；对水生动物的繁殖也会产生一定程度的影响；还有可能影响水生动物的可食性。

2.1 对水生动物基因的影响

石油烃被水生动物吸收，会对水生动物的基因造成不同程度的影响，一方面会影响全基因组的甲基化水平，导致基因突变。刚锰[13]以马粪海胆为研究对象，发现随着石油烃浓度和暴露时间的增加，与空白组比，当石油质量浓度为50 mg/L时，发现了明显的损伤情况，在该暴露浓度下，暴露时间与马粪海胆管足细胞DNA损伤百分比成正比。此外，SPLOX、WNT8和HNF-6等3种基因的突变率在不断地增加，随着石油烃暴露时间的延长，马粪海胆全基因组甲基化水平明显降低。有研究表明[14]，DNA甲基化水平与癌症密切相关，一部分癌症的发生与DNA低甲基化存在一定的关系。因此，石油烃污染对水生动物可造成明显的DNA损伤，并存在潜在的毒性效应。

另一方面，石油烃有可能导致某些基因表达量增高。厦门第三海洋研究所[15]通过对褐菖鲉的研究，发现被石油污染的褐菖鲉SM-CYP1AmRNA 表达量显著升高。有研究表明[16-18]，在一定时间内CYP4 基因的表达量与曝油浓度呈正相关，推断该基因表达产物可能与机体的解毒功能相关。因此可以将CYP4 基因表达量作为海洋石油污染监测的一种分子标志物，作为海洋石油烃污染的预警信号。

2.2 对水生动物生长和繁殖的影响

石油烃也会对水生动物的生长造成一定的影响。一方面石油烃蓄积在鱼体中，会造成鱼类体型弯曲畸形，改变鱼类的洄游路线[19]；另一方面，石油烃污染会对水生动物卵和仔鱼的存活率造成较大影响。贾晓平等[20]利用南海北部水域中有代表性的污染油种，对3种仔虾和4种仔鱼进行了急性毒性实验，发现石油烃的含量达到致死浓度时，不仅会引起鱼仔和虾仔的大量死亡，而且还会影响水生动物繁殖。

石油烃还会影响鱼卵的孵化。陈民山等[21]采用胜利原油对真鲷、黑鲷及牙鲆的鱼卵及仔鱼进行了毒理实验，发现原油浓度与孵化率存在负相关性，而畸形率和死亡率与石油烃含量呈正相关性。Hallare等[22]用斑马鱼的鱼卵为实验对象，结果表明低浓度的多环芳烃会导致鱼卵提前孵化。

2.3 对可食性的影响

当石油烃污染达到石油烃异味的阈值时，水生动物会散发石油烃异味，从而影响可食性。蔡友琼等[23]以青蛤和文蛤为研究对象，发现当石油烃质量分数达到3.0～3.5 μg/g时，贝类就出现异味，当石油烃质量分数达到5.0 μg/g左右时，则有比较明显的异味。

多环芳烃作为石油烃的主要成分，是最早被发现的具有致突变、致畸和致密效应的污染物之一，所以被石油烃污染的鱼类被人类食用，存在一定的致癌风险。孙闰霞等[24]对多环芳烃的致癌风险评价方法进行了综述，分别给出了以致癌系数10-5作为可接受致癌风险水平时，水生动物的日均最大消费量(CRlim)和可食用生物组织器官的污染物质量分数的上限值(SVc, USEPA推荐值为湿重0.67 ng/g)的计算方法。因此，当水生动物中石油烃含量达到一定浓度时，会超过可食用临界值。

3 水生动物中石油烃及其重要组分多环芳烃的检测方法

目前，用于检测水生动物中石油烃的方法主要为荧光分光光度法。仅1998年尚龙生等[25]研究了紫外分光光度法测定贻贝体内石油烃含量的方法。1997年宋云利等[26]应用气相色谱测定过石油烃，将贝类软体组织皂化后，用正己烷萃取后浓缩过柱，分别用正己烷、三氯甲烷洗脱烷烃类组分和芳烃类组分，将各组分浓缩后上机，选择合适的气相色谱条件，发现所有芳烃和正构烷烃组分都能够被完全分离。多环芳烃作为石油烃的重要组分，也被广泛关注，目前用于检测水生动物中多环芳烃的方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)和高效液相色谱法(HPLC)。

3.1 水生动物中石油烃的检测方法

在GB 17378.6—2007实施之后，用于检测水生动物中石油烃的方法主要是是荧光分光光度法，该方法具有操作简便且检出限低(0.2 μg/g)等特点[27]，其相关参数见表1。

表1 荧光分光光度法测定水生动物中石油烃的相关参数Tab.1 Relative parameters of fluorescence spectrophotometry for determining the content of petroleum hydrocarbons inaquatic animals

由于部分水生动物组织中含有大量的脂肪，在提取石油烃之前，将其去除，能消除其对实验结果的干扰。但同时萃取溶剂和溶解溶剂也会对提取效率造成一定程度的影响，近几年国内有多位学者对前处理方法进行了探索(表2)。

表2 荧光分光光度法检测水生动物中石油烃含量的相关研究Tab.2 Relative studiesondetermination of petroleum hydrocarbons in aquatic animals by fluorescence spectrophotometry

注：—表示无，下同。

从表2可知，由于水生动物中含有一定量的脂肪，皂化能有效去除干扰，近几年国内的研究基本都进行了皂化。提取方法有避光室温提取、避光控温提取、超声提取和加速溶剂萃取法等，前两种方法提取时间较长。马瑞欣等[28]采用35 ℃避光提取，与国标基本一致的方法处理样品，虽然可以获得较高的回收率，但是存在用时长，操作工序复杂的缺点。后两种方法提取时间较短，且简单易操作。薄尔琳等[29]加醇与皂化同时进行，有效缩短了提取时间。蒋凤华等[30]采用超声提取工艺，提取时间短，检出限低，回收率相对偏低，但符合要求。夏炳训等[31]采用加速该溶剂萃取法进一步缩短了提取时间，作者将此方法与国标法进行对照，发现此方法的回收率高于国标法(88.0%～95.3%)，但未给出该方法的检出限。其中蒋凤华等[30]采用超声提取工艺避免了皂化反应，一方面节约了实验时间，另一方面避免了样品的损失，与薄尔琳等[29]的方法相比，更适合大批量样品的测定。

国外近几年的文献[32-33]较少见到测定水生动物中石油烃的报道，水中和沉积物中石油烃的测定较多，使用的标准多为I.S. EN 14039—2004[34]，采用丙酮/n-庚烷(1∶1，V/V)，微波提取(150 ℃，15 min)提取样品，提取液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液再用正庚烷定容至10 mL，再经气相色谱仪测定石油烃(C10～C40的总石油烃(total petroleum hydorcarbons，TPH)的含量。

3.2 石油烃中多环芳烃的检测方法

石油烃当中含有5%～10%芳香烃，由多环芳烃和单环芳烃组成，其中多环芳烃由于具有致癌、致畸和致突效应而被广泛关注，目前有6种多环芳烃还被国家环保局列入中国环境优先污染物黑名单[35]。GC-MS被广泛用于水生动物中多环芳烃的测定，相关部门在2008年颁布了水产行业标准SC/T 3042—2008，将GC-MS用于检测水产品16种多环芳烃[36]。HPLC由于适于高沸点、高分子量以及同分异构体的多环芳烃组分的测定，在水生动物中多环芳烃的检测应用中也较多[37]。水生动物中多环芳烃的检测研究见表3。

表3 水生动物中多环芳烃含量测定的相关研究Tab.3 Relative studies on determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in aquatic animals

由表3可知，2种检测方法均能满足的水产行业标准的要求，回收率也基本符合要求。

目前多环芳烃的提取方法主要有传统的振荡提取、超声提取、微波消解和QuEChERS提取。其中传统的振荡提取存在耗时长的缺点，其余3种方法均能有效地缩短提取时间。刘冰等[38]采用超声提取，样品不用经过皂化； Kamankesh等[39]采用微波提取和皂化，用时短，检出限低，回收率符合要求； Johnson[40]采用QuEChERS提取，只需0.2 h，且检出限和回收率均符合要求。QuEChERS提取方法是美国农业部Anastassiades等[41]于2003年开发的，快速(Quick) 、简便(Easy) 、廉价(Cheap) 、有效(Effective) 、耐用(Rugged) 、安全(Safe) 的残留检测前处理方法受到很多研究者的青睐，经过改进的QuEChERS提取方法能获得更好的提取和净化效果，值得相关研究借鉴。

何苑雯[42]缩短了皂化时间，采用传统振荡提取方法，回收率符合要求。刘伶俐等[43]采用微波消解的提取方法，样品不需经过皂化，微波提取时间为0.42 h，操作简单，提取时间短；郭萌萌等[44]采用改进的QuEChERS提取，具有简单、高效等特点，将试剂加入样品，高速匀浆1 min，离心2 min，重复一次，合并上清，氮吹后即可进样。Ishizaki等[45]采用超声提取，HPLC-FLD方法检出限很低，回收率大于70%，适用于痕量分析。

萃取试剂、净化方式和洗脱试剂对实验结果影响较大，目前使用的萃取试剂有环己烷、正己烷/二氯甲烷、乙腈、四氯乙烯和甲醇等；净化方法主要有过柱和固相萃取；洗脱试剂有甲醇、正己烷/丙酮、环己烷/二氯甲烷、乙腈、丙酮和正己烷，在实际的操作中有必要对萃取试剂、净化方式和洗脱方式进行优化。

4 小结

石油烃对水生动物造成了严重的危害，包括水生动物基因、繁殖和海产品可食性等几个方面。检测水生动物中石油烃的方法主要是荧光分光光度法，传统的先加碱液后加无水乙醇的方法存在用时长及操作复杂等缺点，将二者同时加入可以相对缩短皂化时间；超声提取和加速溶剂萃取法不仅大大缩短了前处理时间，而且减少了操作工序，适用于大批量样品的测定。多环芳烃是石油烃的重要组分，目前检测方法主要是气相色谱-质谱法和高效液相色谱法，样品提取方法对实验效率和实验结果有一定的影响，其中超声提取、微波提取和改进的QuEChERS提取方法操作较为简单，结果符合水产行业标准，值得相关研究借鉴。

[1] 姜殿民. 谁该为我们海洋的安全负责[J]. 交通节能与环保, 2008,13(2):4-5.

[2] 李静, 宫向红, 乔丹, 等. 石油污染对海洋贝类食品安全性影响研究进展[J]. 中国渔业质量与标准, 2015, 5(1):35-41.

[3] 王召会, 田甲申, 王摆, 等. 大连斑海豹国家级自然保护区动物体内石油烃污染状况[J]. 水产科学, 2014, 33(4):245-248.

[4] 孙万胜, 王秀芹, 王德兴, 等. 渤海湾(天津近岸)主要海洋生物中石油烃含量调查分析[J]. 天津水产, 2012, 29(2):22-25.

[5] 孙雷, 贾方, 刘江. 沧州近岸海域水产品中石油烃含量调查与分析[J]. 河北渔业, 2015, 29(12):14-19.

[6] 李磊, 蒋玫, 王云龙, 等. 0#柴油和原油水溶性成分在黑鲷(Sparusmacrocephlus)体内的富集动力学研究[C]//2013年中国水产学会学术年会论文集. 合肥：中国水产学会, 2013.

[7] 高萍, 夏斌, 崔毅, 等. 菲律宾蛤仔对石油烃的富集与释放特征[J]. 海洋环境科学, 2013, 32(1):63-66.

[8] 易晓燕, 孟范平, 杜秀萍, 等. 北部湾文蛤对石油烃和多氯联苯的氧化应激响应[J]. 环境科学研究, 2013,26(6):645-652.

[9] 陈丽华, 孙万虹, 李海玲, 等. 石油降解菌对石油烃中不同组分的降解及演化特征研究[J]. 环境科学学报, 2016,36(1):124-133.

[10] 郭平, 林建国, 牛宇驰, 等. 海洋石油烃降解菌的降解性能与固定化研究[J]. 科学技术与工程, 2015,15(27):127-131.

[11] 张海荣, 唐景春, 孙克静, 等. 耐盐碱石油烃降解菌的筛选、鉴定及其耐盐碱性研究[J]. 生物技术通报,2015,31(1):151-159.

[12] 曹云者, 李发生. 基于风险的石油烃污染土壤环境管理与标准值确立方法[J]. 农业环境科学学报, 2010,29(7):1225-1231.

[13] 刚锰.石油烃污染对海洋模式生物海胆的分子毒理效应及机制研究[D]. 大连：大连海事大学, 2013.

[14] 韩竞男, 鲁昊骋, 梁静. DNA甲基化与癌症[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2012,28(2):108-114.

[15] Bo J, Zheng R, Kuang W, et al. The use of rockfishSebastiscusmarmoratusas a sentinel species to assess petroleum hydrocarbons pollution: a case study in Quanzhou Bay, China[J]. Mar Pollut Bull, 2017(1)：1-9.

[16] 靳永轩, 刘晨临, 丛柏林, 等. 栉孔扇贝(Chlamysfarreri)细胞色素CYP4基因表达对石油烃污染的响应特征[J]. 海洋环境科学, 2013,32(2):257-261.

[17] Rewitz K F, Kjellerup C, Jorgensen A, et al. Identification of two Nereis virens (Annelida: Polychaeta) cytochromes P450 and induction by xenobiotics[J]. Comp Biochem Physiol C: Pharmacol Toxicol,2004,138(1):89-96.

[18] Chaty S, Rodius F, Vasseur P. A comparative study of the expression of CYP1A and CYP4 genes in aquatic invertebrate (freshwater mussel,Uniotumidus) and vertebrate (rainbow trout,Oncorhynchusmykiss[J]. Aquat Toxicol, 2004,69(1):81-93.

[19] 赵燕.鲢鱼鱼肉中石油烃污染的红外光谱检测方法的研究[D]. 无锡：江南大学, 2008.

[20] 贾晓平, 林钦. 南海原油和燃料油对仔虾和仔鱼的急性毒性试验[J]. 热带海洋, 1998, 16(1):93-98.

[21] 陈民山, 范贵旗. 胜利原油对海洋鱼类胚胎及仔鱼的毒性效应[J]. 海洋环境科学, 1991, 9(2):1-5.

[22] Hallare A V, Köhler H R, Triebskorn R. Developmental toxicity and stress protein responses in zebrafish embryos after exposure to diclofenac and its solvent, DMSO[J]. Chemosphere, 2004,56(7):659-666.

[23] 蔡友琼, 乔庆林, 徐捷. 贝类产生异味的体内石油烃阈值试验[J]. 上海水产大学学报, 2001,10(2):176-178.

[24] 孙闰霞, 林钦, 柯常亮, 等. 海洋生物体多环芳烃污染残留及其健康风险评价研究[J]. 南方水产科学,2012 , 8 (3) :71-78.

[25] 尚龙生, 孙茜, 徐恒振, 等. 紫外分光光度法测定贻贝体内石油烃的方法研究[J]. 海洋环境科学, 1998, 16(1):63-66.

[26] 宋云利, 孙耀. 毛细管气相色谱法测定海洋贝类体内的石油烃[J]. 渔业科学进展, 1997, 17(1):67-72.

[27] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB 17378.6—2007 海洋监测规范[S]. 北京：中国标准出版社, 2007.

[28] 马瑞欣, 苏欢欢, 梁艳红, 等. 荧光分光光度法测定水产品中的石油烃[J]. 河北渔业, 2014, 28(9):29-30.

[29] 薄尔琳, 郭楠, 罗靳, 等. 荧光分光光度法测定水产品中的石油烃污染物[J]. 辽宁农业科学, 2015, 56(3):27-30.

[30] 蒋凤华, 赵美丽, 王晓艳, 等. 超声波提取-荧光法测定贝类体内石油烃含量[J]. 海洋环境科学, 2012,31(6):906-909.

[31] 夏炳训, 宁璇璇, 姜军成, 等. 加速溶剂萃取法提取海洋贝类体中石油烃的方法[J]. 海洋环境科学, 2013, 32 (2):300-303.

[32] Zhang Z, Lo I M. Biostimulation of petroleum-hydrocarbon-contaminated marine sediment with co-substrate: involved metabolic process and microbial community[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(13):5683-5696.

[33] Al-Baldawi I A, Abdullah S S R, Anuar N, et al. Phytodegradation of total petroleum hydrocarbon (TPH) in diesel-contaminated water usingScirpusgrossus[J]. Ecol Eng, 2015,74:463-473.

[34] EN. EN 14039:2004 Characterization of waste - Determination of hydrocarbon content in the range of C10 to C40 by gas chromatography [S]. British：European Committee for Standardization, 2004.

[35] 岳敏, 谷学新, 邹洪, 等. 多环芳烃的危害与防治[J]. 首都师范大学学报(自然科学版), 2003,24(3):40-44.

[36] 中华人民共和国农业部渔业局，全国水产标准技术委员会.SC/T 3042—2008 水产品中16种多环芳烃的测定气相色谱-质谱法[S]. 北京：中国标准出版社, 2008.

[37] 王丽娟. 水产品中多环芳烃的检测方法及污染特征研究进展[J]. 渔业研究, 2016,38(4):343-350.

[38] 刘冰, 霍鲁格. 气相色谱-三重四级杆串联质谱法检测鱼肉中多环芳烃的研究[J]. 现代食品科技, 2013(6):1395-1399.

[39] Kamankesh M, Mohammadi A, Hosseini H. Rapid determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in grilled meat using microwave-assisted extraction and dispersive liquid-liquid microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry [J]. Meat Sci, 2015,103(1):61-67.

[40] Johnson Y S. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible seafood by quEChERS-based extraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Sci, 2012,77(7):131-137.

[41] Anastassiades M, Lehotay S J. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction ” for the determination of pesticide residues in produce[J].J Aoac Int, 2003,86(2):412-430.

[42] 何苑雯. 水产品中多环芳烃含量测定方法[J]. 科学之友, 2013,34(10):32-33.

[43] 刘伶俐, 洪波, 杨霄, 等. 水产品中16种多环芳烃的前处理方法[J]. 分析试验室, 2016, 34(4):482-486.

[44] 郭萌萌, 吴海燕, 杨帆, 等. 改进的QuEChERS-高效液相色谱法测定水产品中16种多环芳烃[J]. 环境化学, 2013, 31(6):1025-1031.

[45] Ishizaki A, Saito K, Hanioka N, et al. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in food samples by automated online in-tube solid-phase microextraction coupled with high-performance liquid chromatography-fluorescence detection[J].J Chromatogr A, 2010,1217(35):5555-5563.

Effectsofpetroleumhydrocarbonstoaquaticanimalsandtheirdeterminationmethods

LUO Longjuan, ZHANG Yong*, WANG Haiyu

(Guangzhou Ocean and Fishery Environment Monitoring Center， Guangdong 501235, China)

Petroleum hydrocarbons have become one of the most important pollutants in the sea due to oil pollution accidents. Large quantities of petroleum hydrocarbons would cause serious harm to aquatic animals. Effective determination methods can monitor the content of petroleum hydrocarbons in aquatic animals, and timely carry out corresponding solution for oil pollution accidents. In this paper, the petroleum hydrocarbons composition, their harm to aquatic animals, and their determination methods were summarized in order to provide references for relative studies.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(5):18-24]

petroleum hydrocarbons, aquatic animals，hazards, determination methods

ZHANG Yong,736836267@qq.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.003

S91

A

2095-1833(2017)05-0018-07

2017-03-22；接收日期2017-06-25

广东省农产品质量安全项目(2130109)

罗龙娟(1988-)，女，硕士，助理工程师，研究方向为海洋环境监测与保护，luolongjuan1217@126.com

张勇，高级工程师，研究方向为海洋环境监测与保护,736836267@qq.com