创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体的制备及其特性分析

古小莉，李永贤，李惠青，陈洁文,李刘冬

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室， 广东 广州 510300)

创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体的制备及其特性分析

古小莉，李永贤，李惠青，陈洁文,李刘冬*

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室， 广东 广州510300)

[目的]制备创伤弧菌特异性抗体，为建立免疫学快速检测创伤弧菌提供参考依据。[方法]以创伤弧菌外膜蛋白作为抗原，将抗原分多次免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体，采用蛋白G亲和层析法纯化多克隆抗体，通过间接ELISA和WesternBlot测定创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。[结果]实验获得了纯度较高的创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体，效价为1∶64000；抗体对创伤弧菌具有高的特异性，它与多株致病菌均无明显交叉反应，其对创伤弧菌检测灵敏度为103CFU/mL；WesternBlot分析表明，制备的多克隆抗体能识别创伤弧菌外膜蛋白，创伤弧菌外膜蛋白具较强的抗原性。[结论]创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性，可应用于创伤弧菌的快速、灵敏的免疫学检测。[中国渔业质量与标准，2017,7(5):45-50]

创伤弧菌；外膜蛋白；多克隆抗体；WesternBlot；ELISA

创伤弧菌(Vibriovulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，其广泛存在于河口、海洋环境和海产品中，是危害许多海水养殖动物的主要病原菌之一，同时也能够使人类致病，引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症[1-2]。鉴于创伤弧菌致病的危害性，建立特异、灵敏的检测方法尤为迫切。目前，创伤弧菌快速检测方法主要有免疫学方法和分子生物学方法[3-4]，其中免疫学方法以具有特异性强、敏感性高、检测时间短等优点受到众多研究者的青睐[5-6]。研制创伤弧菌高特异性的抗体，是建立免疫学快速检测创伤弧菌的重要基础。

革兰氏阴性细菌表面的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)与细菌的致病性及免疫保护性密切相关，外膜蛋白在细菌表面存在裸露的抗原表位，具有较强免疫原性，能刺激机体产生抗体及某些细胞因子[7-9]。目前，国内外关于创伤弧菌外膜蛋白的研究主要集中在抗原性和免疫刺激复合物分析[10-12]，但以创伤弧菌外膜蛋白作抗原制备特异抗体的研究较少。李素一等[13]在创伤弧菌外膜蛋白OmpU的免疫原性研究中，制备的创伤弧菌外膜蛋白OmpU多克隆抗体验证可以识别创伤弧菌外膜蛋白OmpU，但未对抗体的特性作进一步的研究。为深入了解创伤弧菌外膜蛋白抗体的特性，本研究以创伤弧菌外膜蛋白作为抗原制备多克隆抗体，探讨抗创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体的特异性，以期为建立创伤弧菌的快速、灵敏的免疫学检测方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

实验菌株均购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心，菌株列表见表1。

表1 菌株列表Tab.1 Strains list

1.1.2 实验动物

纯系新西兰大白兔购自广州中医药大学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂

弗氏(完全/不完全)佐剂、Tris-HCl、甘氨酸、HRP标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自广州杰伟特生物科技有限公司；碱性蛋白胨水购自广州环凯生物科技有限公司；蛋白G亲和层析柱(HiTrap Protein G HP)购自美国GE Healthcare公司；TBST及PMSF购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多克隆抗体的制备

1.2.1.1 抗原(外膜蛋白)的制备

参照改进的PMSF法[11]，将创伤弧菌接种于3% NaCl碱性蛋白胨水，37 ℃振荡培养24 h。将培养的创伤弧菌菌液于100 ℃水浴灭活5 min，取200 mL于离心管中，4 ℃ 7 043 g离心20 min，弃上清液，收集沉淀。将收集的菌体沉淀加PMSF反复冻融并进行超声破碎6 min(功率200 W，工作30 s，间隔5 s)，将裂解后的菌液4 ℃ 13 805 g离心20 min，收集上清液，并将上清液进行SDS-PAGE电泳[14]，用Bio-Rad公司Quantity One 4.62软件计算分子量。

1.2.1.2 多克隆抗体的制备

将制备的创伤弧菌外膜蛋白200 μL(蛋白浓度约2.5 mg/mL)与弗氏佐剂1∶1(V/V)混合，振荡混匀，采用多点(颈部、脚掌和腹股沟)皮下注射免疫新西兰大白兔，进行三次免疫，首次免疫20 d，二次免疫10 d，三次免疫10 d(首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂)。免疫结束，取免疫新西兰大白兔血清，将血清于-20 ℃保存备用。

1.2.1.3多克隆抗体的纯化

参照《蛋白质技术手册》亲和层析法[15]，用蛋白G亲和层析柱HiTrap Protein G HP纯化抗血清，以pH 3.0的0.1 mol/L 甘氨酸-HCl缓冲液洗脱，收集的洗脱液为纯化的多克隆抗体，将纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳。

1.2.2 多克隆抗体特性分析

1.2.2.1 多克隆抗体的效价测定

采用间接ELISA法[16]测定创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体(免疫血清)效价，酶标仪设定波长为492 nm。

1.2.2.2 敏感性试验

将108CFU/mL创伤弧菌菌悬液，进行10倍梯度递减稀释至102CFU/mL，将待测血清及阴性血清按1∶4 000稀释，羊抗兔IgG以1∶1 000稀释，通过间接ELISA法确定最小抗原检测浓度。以所产生的P/N值大小作为判断标准，当P/N值≥2.1判定为阳性[17]。P/N值=(阳性对照OD492值-空白对照OD492值)/(阴性对照OD492值-空白对照OD492值)。

1.2.2.3 交叉试验

将浓度为107CFU/mL的创伤弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌于37 ℃水浴包被酶标板，阴性血清和阳性血清均采用1∶4 000的稀释度进行间接ELISA检测，确定交叉反应情况。

1.2.2.4 免疫印迹试验(Western Blot)

参照文献[18]，将创伤弧菌外膜蛋白、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌进行SDS-PAGE电泳后，取出凝胶，漂洗数秒，将PVDF膜和滤纸置于转移缓冲液(0.025 mol/L Tris； 0.192 5 mol/L Gly； 20%甲醇)中湿润5～ 10 min。按照阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极的顺序安放好三明治的转运槽。冰浴转膜250 mA，1 h。转移后的PVDF膜用5%脱脂牛奶37 °C封闭缓慢振荡2 h；加入1∶1 500稀释的纯化后的多克隆抗体后在37 °C摇床上孵育1 h，TBST漂洗(4次，每次10 min)，以正常兔血清作为阴性对照；加入用HRP标记的羊抗兔IgG(1∶8 000倍稀释)，37 °C缓慢振荡1 h，室温TBST漂洗(4次，每次10 min)，最后用HRP-ECL发光法观察结果。

2 结果

2.1 多克隆抗体的制备及纯化

创伤弧菌外膜蛋白SDS-PAGE分析结果(图1)可见，创伤弧菌外膜蛋白主要集中在15～130 kD分子量范围内，共可发现大约有20条蛋白条带，其中主要条带有11条，分子量分别约为112、 84、 77、 72、 60、 56、 50、 46、 42、 36和20 kD，其中56、 36和20 kD条带最清晰，蛋白浓度高。

经Protein G亲和层析纯化后的抗体SDS-PAGE显示(图2)，抗体经纯化后得到两个蛋白条带，一条55 kD左右的重链，一条28 kD左右的轻链，无多余条带，表明纯化后的抗体纯度较高。

图1 创伤弧菌外膜蛋白SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE of outer membrane proteins of Vibrio vulnificus

图2 纯化创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体SDS-PAGE图谱1：分子量标准蛋白；2：纯化创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体。Fig.2 SDS-PAGE image of purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus1：Marker; 2：Purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus.

2.2 多克隆抗体的效价

用间接ELISA法检测创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体效价，结果显示多克隆抗体效价为1∶64 000(图3)，制备的创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体获得了较高的效价。

图3 创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体效价曲线Fig.3 Titer curve of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus

2.3 敏感性

用不同浓度的创伤弧菌液(108、 107、 106、 105、 104、 103和102CFU/mL)为抗原，进行间接ELISA测定，结果见表2。由表2可知，当菌液浓度为103CFU/mL时，P/N值为2.15，即为阳性反应，该抗体可检测最低菌液浓度为103CFU/mL。

2.4 交叉反应

通过间接ELISA测定，抗体与创伤弧菌反应呈强阳性，与溶藻弧菌和副溶血性弧菌有微弱的交叉反应，与鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等水产动物中常见的病原菌均无交叉反应(表3)。

2.5 免疫印迹

用制备的创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体与创伤弧菌外膜蛋白及几种试验菌株的Western Blot见图4。Western Blot结果可见，创伤弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌出现了不同程度的免疫反应带；创伤弧菌外膜蛋白共有7条明显的免疫反应带，分子量分别约为72、 60、 50、 36、 35、 34和20 kD；溶藻弧菌和副溶血性弧菌的免疫反应带均较弱，溶藻弧菌有2条反应带，副溶血性弧菌有1条反应带；在分子量约为36 kD处，创伤弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌均有一条免疫反应带；鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌均无反应带出现。

表2 多克隆抗体敏感性实验结果Tab.2 The result of sensitivity assay of polyclonal antibody

注：“-”为阴性(P/N<2.1)，“+”为阳性(P/N≥2.1)。

表3 多克隆抗体交叉实验结果Tab.3 The result of cross reaction assay of polyclonal antibody

注：“-”～“++++”表示反应强度依次增加的5种程度，其中P/N<2.1为“-”，2.1≤P/N<6.1为“+”，6.1≤P/N<10.1为“++”，10.1≤P/N<14.1为 “+++”，P/N>14.1为“++++”。

图4 Western Blot分析创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体特性1：分子量标准蛋白；2：创伤弧菌外膜蛋白；3：溶藻弧菌；4：副溶血性弧菌；5:鼠伤寒沙门氏菌；6：大肠埃希氏菌O157； 7：单核细胞增生李斯特氏菌；8：金黄色葡萄球菌；9：阴性对照。Fig.4 Western Blot analysis on the character of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus 1：Marker；2：Outer membrane proteins of Vibrio vulnificus；3：Vibrio alginolyticus；4：Vibrio parahaemolyticus；5：Salmonella typhimurium；6：E.coli O157；7：Listeria monocytogenes；8：Staphylococcus aureus；9：Negative serum.

3 讨论

创伤弧菌的外膜蛋白与细菌致病性及免疫保护性密切相关，在决定宿主免疫反应的特异上起着重要作用[11，19-21]。有研究报道创伤弧菌外膜蛋白有较强的抗原性[11，20]，本研究将创伤弧菌外膜蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，制备了创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体。

SDS-PAGE分析发现创伤弧菌外膜蛋白条带比较密集，其主要蛋白条带清晰，分布在15～130 kD之间，与田丁等[11]报道的创伤弧菌主要外膜蛋白带在14～92 kD之间的结果不完全一致，只有84、 60和36 kD的蛋白为共同条带。有研究[22-24]认为同种细菌外膜蛋白的差别可能与细菌的培养条件、外膜蛋白的制备方法、菌株的致病性和血清型不同有关。值得注意的是，创伤弧菌外膜蛋白主要条带中的36 kD蛋白，已有许多研究证实其为弧菌外膜蛋白先共有成分[23-26]。

抗体交叉反应发现，创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体与创伤弧菌呈现强的阳性反应，与溶藻弧菌和副溶血性弧菌存在较弱的交叉反应，与其他试验菌株无交叉反应，可见试验制备的创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体与创伤弧菌具有较高的特异性。使用该多抗检测创伤弧菌时，为避免出现假阳性，可对样品进行增菌(增加样品外膜蛋白丰度)再进行检测。

Western Blot分析显示，创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体与创伤弧菌外膜蛋白中的7条蛋白发生不等程度的反应，可见制备的多克隆抗体不仅能够识别创伤弧菌外膜蛋白与其发生免疫反应，同时说明创伤弧菌外膜蛋白具有较强的抗原性。Western Blot结果中36 kD位置处创伤弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌都出现了较弱的反应带，交叉试验中同样具有36 kD外膜蛋白的溶藻弧菌和副溶血性弧菌[23，26]亦与多克隆抗体发生较弱的交叉反应，由此可推测出，虽然创伤弧菌36 kD外膜蛋白发生免疫反应，但反应较弱，不具有强抗原性。其他试验菌株均无免疫反应带，同时结合交叉反应结果，表明了研究制备的多克隆抗体具有较高的特异性。此外，创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体与溶藻弧菌、副溶血性弧菌发生的弱交叉反应，说明创伤弧菌与溶藻弧菌、副溶血性弧菌之间可能存在相同的抗原决定簇。如何将产生相同的抗原的外膜蛋白分离出以提高抗体特异性，有待进一步的研究。

本研究制备的创伤弧菌外膜蛋白多克隆抗体，抗体纯度较高，效价达1∶64 000，其与水产品中常见的致病菌无明显的交叉反应，具有较高的特异性和灵敏性，制备相对容易，可为创伤弧菌快速检测等应用提供参考依据。

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PreparationandcharacterizationofpolyclonalantibodyagainstoutermembraneproteinsofVibriovulnificus

GU Xiaoli， LI Yongxian， LI Huiqing， CHEN Jiewen， LI Liudong*

(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment forAquatic Product on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture)

[Objective] This study aimed to prepare high specific antibody againstVibriovulnificus, and provide references for rapidly screeningVibriovulnificusby immunological method. [Methods] The polyclonal antibody was obtained by injecting the antigen, which was the outer membrane proteins ofVibriovulnificus, to New Zealand rabbits in several times with increasing dose, and purified by protein G affinity chromatography. Indirect ELISA and Western Blot assay were conducted to characterize the titer, sensitivity and specificity of polyclonal antibody. [Results]The polyclonal antibody prepared had high purity, which titer was 1∶64 000. Moreover, the antibody had high specificity forVibriovulnificus. It was no obvious cross reaction with other multiple pathogenic bacteria. The minimum threshold detection limit was 103CFU/mL in pure culture ofVibriovulnificus. Western Blot result showed that the polyclonal antibody could specially identify the outer membrane proteins ofVibriovulnificusand the outer membrane proteins should have good antigenicity. [Conclusion]The polyclonal antibody against outer membrane proteins ofVibriovulnificuswas high specificity and sensitivity, which could be used to rapidly screenVibriovulnificus.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(5):45-50]

Vibriovulnificus; outer membrane protein; polyclonal antibody; Western Blot; ELISA

LI Liudong，168lld@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.007

S91

A

2095-1833(2017)05-0045-06

2017-04-14;接收日期2017-07-10

中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2015TS18，2009TS02，2015TS15);广东省水产品质量安全专项项目(GDSCZA2015009);国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP201501003)

古小莉(1982-)，女，硕士，助理研究员，研究方向为水产品质量安全，lilet_ku@163.com

李刘冬，研究员，研究方向为水产品质量安全，168lld@163.com