温度、湿度、接菌量及pH对烟草青枯病菌致病力的影响

汪汉成，余 婧，蔡刘体，陆 宁

（贵州省烟草科学研究院，烟草行业山地烤烟品质与生态重点实验室，贵阳 550081）

温度、湿度、接菌量及pH对烟草青枯病菌致病力的影响

汪汉成，余 婧，蔡刘体，陆 宁

（贵州省烟草科学研究院，烟草行业山地烤烟品质与生态重点实验室，贵阳 550081）

烟草青枯病菌是土传病原细菌，其致病力易受多种因素影响。采用穿刺法接种离体叶片，系统性地研究了温度、湿度、接菌量和pH对烟草青枯病菌致病力的影响。试验范围内青枯病菌可致病的病原菌数量为1.3～1.3×108cfu，1.3×108cfu病斑面积最大；致病的温度范围为 20～35 ℃，最适为 30～35 ℃，病害潜伏期随着温度升高而变短；40%～100%的相对湿度范围内均可发病；致病pH范围为5.0～8.0，最适发病pH为6.0。影响青枯病菌致病力的关键因子为温度和pH，湿度不是青枯病发生的关键因素，结果为研究烟草青枯病发生机制提供了科学依据。

青枯病菌；致病力；温度；湿度；pH

长期以来，烟叶生产受到烟草土传细菌性病害烟草青枯病（tobacco bacterial wilt）的危害，其病原菌为茄科雷尔氏菌[Ralstonia solanacearum（Smith 1896，Yabuuchi et al. 1996 emend）]。该病害是典型的维管束病害，烟草根、茎、叶各部位均可被侵染，但主要危害植物的根和茎，病株侧根常变黑腐烂，茎部可见黑色条斑[1-2]。该病于1864年在印度尼西亚首次发现，此后，迅速扩展至主要产烟国家并成为制约烟草生产的重要病害[3-4]，目前在我国主要产烟省区均有发生。近年来，由于气候、土壤酸碱度等方面的原因，该病害在我国的危害范围逐步扩大。

烟草青枯病的发生是烟草、病原菌、环境共同作用的结果，烟草青枯病的发生与病原菌的致病力密切相关。致病力是病原菌侵入寄主后引起致病的能力。影响致病力的因素包括温度、湿度、病原菌的浓度、pH等多个方面，同时病原菌菌株间的致病力也存在差异。引起我国烟草青枯病的茄科雷尔氏菌主要为1号小种3号生化型（R1Bv3）[5]。已有的研究表明，30 ℃的环境温度和81.42%以上的相对湿度比较有利于烟草青枯病的发生[6]，同时温度也会影响烟草品种对青枯病的抗性[7]；接菌浓度100～1010cfu/mL时均会引起番茄青枯病的发生[8]。目前，烟草青枯病菌可致病的温度、湿度、病原菌浓度及pH范围仍不清楚。本文以一株烟草青枯病菌致病力菌株为研究对象，对其可致病的温度、湿度、病原菌数量及pH范围进行测定，旨在明确影响烟草青枯病致病力的关键环境因子，为烟草青枯病发生机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株与烟株 试验于2017年2—5月在贵州省烟草科学研究院微生物实验室开展，烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）由该实验室分离鉴定所得。烟草品种为云烟87（Nicotiana tabacum cv.Yunyan 87）。

1.1.2 供试培养基与试剂 烟草青枯病菌的培养使用牛肉膏蛋白胨培养基（NA、NB）[9]、青枯菌专性培养基（SMSA）[10]和（BUG+B）培养基[11]，BUG琼脂由Biolog公司提供，冻干脱纤维羊血（B）由北京友康基业生物科技有限公司提供。青枯病菌不同pH下生长采用的代谢板 PM9、接种液IF-0a GN/GP（#72268）和 IF-10b GN/GP（#72266）、染料Mix A（#74221），均购自美国Biolog公司。

1.2 接种量对烟草青枯病菌致病力的影响

将青枯病菌于NB培养液中30 ℃、170 r/min黑暗培养，48 h后吸取5 mL菌液，从中吸取0.5 mL，用无菌水将菌液依次稀释至 100～10-8。采用 1 mL无菌注射器从 100～10-8的梯度稀释液中分别吸取0.1 mL菌液，采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15 μL菌液，以注射同体积的NB培养基为对照，每个处理重复4次。接菌后将叶片置于30 ℃、RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替的环境下培养，72 h后测量病斑的直径并计算病斑面积。此外，从100～10-8的梯度稀释液中分别吸取0.1 mL菌液，分别将其均匀涂布于制备好的SMSA平板上，每处理重复3次，将接菌后的平板置于30 ℃黑暗条件下培养，72 h后计数平板上长出的菌落数。

1.3 温度对烟草青枯病菌致病力的影响

将青枯病菌于NB培养液中30 ℃、170 r/min黑暗培养，48 h后吸取1 mL菌液，用无菌水将菌液稀释，制备107cfu/mL的菌液。采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15 μL菌液，以注射同体积的NB培养基为对照，每个处理重复4次。接菌后将叶片置于RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替、及不同温度（18、20、25、28、30、35 ℃）的环境下培养，分别于接菌后24、36、60、84、108和132 h观察叶片发病情况，测量病斑的直径并计算病斑面积。

1.4 湿度对烟草青枯病菌致病力的影响

参照上述方法制备青枯病菌107cfu/mL的菌液。采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15 μL，以注射同体积的NB培养基为对照，每个处理重复4次。接菌后将叶片置于30 ℃、16 h黑暗和8 h光照交替、及不同相对湿度（40%、60%、80%、100%）的环境下培养，分别于接菌后72 h观察叶片发病情况，测量病斑的直径并计算病斑面积。

1.5 pH对烟草青枯病菌致病力的影响

将烟草青枯病菌在BUG+B平板上纯化培养2代，参照Biolog革兰氏阴性细菌代谢的操作规程[12]进行烟草青枯病菌的不同pH环境下的生长培养，30 ℃培养5 d后取出培养菌液。用1 mL无菌注射器从pH 3.5～10的菌液中分别吸取0.1 mL菌液，采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15 μL菌液，以注射同体积的无菌水为对照，每处理重复4次。接菌后将叶片置于30 ℃、RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替的环境下培养，72 h后观察叶片发病情况，测量病斑的直径并计算病斑面积。此外，吸取0.1 mL pH 3.5～10范围内的青枯菌培养液，将菌液用无菌水进行梯度稀释，吸取0.1 mL稀释液均匀涂布于制备好的SMSA平板上，每处理重复3次，将接菌后的平板置于30 ℃黑暗条件下培养，72 h后计数平板上长出的菌落数。

2 结 果

2.1 接菌量对烟草青枯病菌致病力的影响

如表1所示，在烤烟云烟87的离体叶片上，烟草青枯病菌在1.3～1.3×108cfu的接菌范围内均可使烟草叶片致病，接菌量1.3×102cfu 48 h时，发病面积可达0.63 cm2，接菌量不影响病斑扩展面积。

2.2 温度对烟草青枯病菌致病力的影响

结果如表2所示，烟草离体叶片接菌15 μL的107cfu/mL的菌液，在18～35 ℃的温度范围内，除18 ℃外，烟草青枯病菌均具有致病力；20 ℃时，青枯病菌接菌 84 h后才开始使离体叶片发病；25～30 ℃处理，接菌36 h后叶片开始发病；35 ℃处理24 h后叶片就开始发病。在24～132 h的培养时间内，各温度处理下的烟草叶片发病面积均会随着培养时间的延长而逐渐扩大。此外，在20～35 ℃的测试温度范围内，36～132 h各时离体叶片的发病面积均随着温度的升高而增大。

2.3 湿度对烟草青枯病菌致病力的影响

测定结果表明，相对湿度 40%、60%、80%和100%的条件下，烟草离体叶片穿刺接种 15 μL的107cfu/mL的菌液，青枯病菌均可使叶片发病，其平均病斑面积分别为0.87、1.04、0.87和0.95 cm2。

表1 烟草青枯病菌接菌量在烟叶上对其致病力的影响Table 1 Effect of inoculum quantity on Ralstonia solanacearum pathogenicity in tobacco leaf

表2 温度对烟草青枯病菌在烟叶上致病力的影响Table 2 Effect of temperature on Ralstonia solanacearum pathogenicity in tobacco leaf

2.4 pH对烟草青枯病菌致病力的影响

结果如表3所示，在pH 3.5～10.0的测试范围内，烟草青枯病菌可生长的pH范围为5.0～9.0，最适为6.0，pH 3.5～4.5和9.5～10.0的环境下青枯病菌均不能存活。在相同的接菌体积下，pH 6.0处理的菌落数量可达1.4×1010cfu，其次为pH 5.0、7.0、5.5和8.0的处理，pH 8.5和9.0处理的菌落数最小（1.7×103cfu）。不同pH下的致病力测定结果（表3）表明，烟草青枯病菌可致病的pH范围为5.0～8.0，该范围内的离体叶片发病面积均随叶片培养时间的延长而逐渐增大；pH 8.5和pH 9.0的处理，青枯病菌虽能存活，但离体烟草叶片培养120 h内均未发病。

3 讨 论

烟草青枯病菌是世界性的土传病原细菌，寄主广，变异强，难以防治。本文以中抗品种云烟 87为材料，采用单因子试验，开展了温度、湿度、接菌量和pH对烟草青枯病菌致病力影响的系统性研究，获得了烟草青枯病菌致病的病原菌数量范围为1.3～1.3×108cfu，致病的温度范围为 20～35 ℃，致病的湿度范围为 40%～100%，致病的 pH范围为5.0～8.0。

表3 pH对烟草青枯病菌在烟叶上致病力的影响Table 3 Effect of pH on Ralstonia solanacearum pathogenicity in tobacco leaf

温度是重要的环境因素，对植物病原菌的生长和病害的发生均具有较大的影响。据报道番茄青枯病菌在液体培养基中最适生长温度为 30 ℃[8]，青枯病菌侵染番茄的最低温度为 22 ℃，且温度越高病害发生的潜伏期越短[13]；30 ℃最有利于辣椒青枯病的发生[14]；大部分青枯病菌菌株在20 ℃以下没有致病力，但青枯病菌 3号小种 2号生化型（R3Bv2）被报道 18 ℃时在土豆和番茄上可以致病[15-16]；烟草青枯病菌的可生长温度范围为15～43 ℃，28.52 ℃为病原菌在平板上的最适生长温度，同时 30 ℃左右为烟草青枯病发展的最有利温度[17]；30 ℃和35 ℃时不同青枯病抗性的烟草品种均会被青枯病菌侵染[7]。本文采用的离体叶片穿刺接种的方法虽然与上述研究不同，但获得的烟草青枯病菌致病力温度范围同上述报道基本一致。

烟草青枯病菌是土传细菌性病害，土壤pH环境影响着它的定殖和侵染。据报道一些烟草青枯病菌菌株可以存活的pH范围为5.0～9.5[18]，青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好[19]。本文所测得的青枯病菌可存活的pH范围为5.0～9.5，研究结果与之前报道一致。MICHEL等[20]报道了不同类型土壤中不同pH的土壤处理措施对青枯病病情指数影响，仅在土壤环境中评价了青枯病菌的病情指数与pH的关系。pH对青枯病菌致病力影响方面未见报道，本文首次系统性地评价了pH对青枯病菌致病力的影响。青枯病菌虽然在pH 8.5～9.0的范围内能够存活，但并不能致病，该结论为通过改良土壤pH来防控青枯病提供了科学依据。

本文发现湿度和青枯病菌的数量为烟草青枯病发生的非必要因素。烟草青枯病菌的环境适应能力较强[18]，可供其生长的营养物质范围广泛，在无氮的情况下仍然能够生长[5]。只要温度合适，该病原菌就能迅速繁殖，在寄主存在的条件下，就能侵染烟草进而造成危害。湿度虽不是其致病力的关键因子，但对病害的流行与传播起到积极作用。

[1] ROBERTSON A E, WECHTER W P, DENNY T P, et al.Relationship between a virulence gene (avrA) diversity in Ralstonia solanacearum and bacterial wilt incidence [J].Molecular plant-microbe interactions, 2004, 17(12):1376-1384.

[2] QIAN Y L, WANG X S, WANG D Z, et al. The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco (N. tabacum L.)[J]. Euphytica, 2013, 192:259-266.

[3] HAYWARD A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J]. Annual review of phytopathology, 1991, 29(1): 65-87.

[4] HAYWARD A C. Ralstonia solanacearum[J].Encyclopedia of microbiology, 2000, 32-42.

[5] WANG H C, HUANG Y F, WANG J, et al. Phenotypic fingerprints of Ralstonia solanacearum Biovar 3 strains from tobacco and tomato in China assessed by Phenotype microarray analysis[J]. Plant pathology journal, 2015,14(1): 38-43.

[6] 李想，刘艳霞，蔡刘体，等. 烟草青枯病菌在烟草根际的定殖及最适发病条件[J]. 植物保护学报，2016，43（5）：796-804.

[7] BITTNER R J, ARELLANO C, MILA A L. Effect of temperature and resistance of tobacco cultivars to the progression of bacterial wilt, caused by Ralstonia solanaceearum[J]. Plant soil, 2016, 408: 299-310.

[8] SINGH D, YADAV D K, SINHA S, et al. Effect of temperature, cultivars, injury of root and inoculums load of Ralstonia solanacearum to cause bacterial wilt of tomato[J]. Archives of phytopathology and plant protection, 2014, 47(13): 1574-1583.

[9] SHAHIDI B G H, BARKHORDAR B, PAKGOHAR N,et al. Biological control of Phytophthora drechsleri tucker, the causal agent of pistachio gummosis, under greenhouse conditions by use of actinomycetes[J]. Plant pathology journal, 2006, 5: 20-23.

[10] IMAZAKI I, NAKAHO K. Pyruvate-amended modified SMSA medium: improved sensitivity for detection of Ralstonia solanacearum[J]. Journal of general plant pathology, 2010, 76: 52-61.

[11] 汪汉成，王茂胜，黄艳飞，等. 烟草青枯病菌拮抗菌株X-60的分离鉴定及其表型组学分析[J]. 植物病理学报，2016，46（3）：409-419.

[12] BOCHNER B R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships[J]. Nature reviews genetics, 2003, 4: 309-314.

[13] 卓国豪. 温度和病原菌接种浓度对番茄青枯病菌侵染的影响[J]. 植物检疫，2005，19（3）：143-144.

[14] TRAN N H, KIM B S. Influence of temperature,pathogen strain, inoculum density, seedling age,inoculation method and varietal resistance on infection of pepper seedlings by Ralstonia solanacearum[J].Horticulture, environment, and biotechnology, 2010,51(2): 95-100.

[15] BOCSANCZY A M, ACHENBACH U C M,MANGRAVITA-NOVO A, et al. Comparative effect of low temperature on virulence and twitching motility of Ralstonia solanacearum strains present in Florida [J].Phytopathology, 2012, 102: 185-194.

[16] 莊明富，罗淑芳，林静宜. 温度对青枯病菌致病力之影响与马铃薯品种（系）对青枯病反应之初步评估[J]. 台湾农业研究，2015，64（2）：89-98.

[17] 刘宪臣. 温湿度对烟草青枯病发生的影响及调控技术研究[D]. 重庆：西南大学，2014.

[18] CHEN X J, LI L C, WANG H C, et al. Phenotypic fingerprints of Ralstonia solanacearum under various osmolytes and pH environments [J]. Plant pathology journal, 2016, 15(3): 102-107.

[19] 谭军，刘雨虹，刘影，等. 不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响[J]. 中国烟草科学，2014，35（1）：85-88.

[20] MICHEL V V, MEW T W. Effect of a soil amendment on the survival of Ralstonia solanacearum in different soils[J]. Phytopathology, 1998, 88(4): 300-305.

Effect of Temperature, Relative Humidity, Inoculum Amount and pH on Pathogenicity of Ralstonia solanacearum on Tobacco

WANG Hancheng, YU Jing, CAI Liuti, LU Ning

( Guizhou Academy of Tobacco Science, Upland Flue-cured Tobacco Quality & Ecology Key Laboratory of China Tobacco,Guiyang 550081, China)

Ralstonia solanacearum is a worldwide soil born bacterium on tobacco, and its pathogenicity is affected by many factors but the key factors are still unclear. In this study, the effect of temperature, relative humidity, inoculum amount and pH on pathogenicity of R. solanacearum was systematically analyzed. The method of stab inoculation on detached leaves was used throughout the whole experiment. The results showed that the pathogenic amount of R. solanacearum was between 1.3 cfu and 1.3×108cfu, and the biggest scab in detached tobacco leaves was observed in the treatment of 1.3× 108cfu. The pathogenic temperature of the bacterium was from 20 ℃ to 35 ℃, and the best range was from 30 ℃ to 35 ℃, showing decreased incubation period with the raise of temperature. Tobacco bacterial wilt could happen under the relative humidity range of 40% to 100%, thus humidity was not the key factor for this disease. The pathogenic pH value range was from 5.0 to 8.0, and the best value was around 6.0. In conclusion, temperature and pH value were the key factors for pathogenicity of R. solanacearum. These results provided scientific evidence for occurrence mechanism of tobacco bacterial wilt.

Ralstonia solanacearum; pathogenicity; temperature; humidity; pH

S435.72

1007-5119（2017）05-0008-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.002

中国博士后科学基金资助项目“基于土壤微生物量的烟草青枯病根际微生态的研究”（2017M610585）；贵州省科技支撑计划“侵染裂解烟草青枯菌的噬菌体资源库构建及应用研究”（黔科合支撑[2017]2606号）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“解淀粉芽孢杆菌和烟草青枯病菌的营养需求特性研究”（2013-05）

汪汉成（1982-），男，博士，研究员，从事烟草植保与微生物方面的研究。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com

2017-05-05

2017-08-04