黑龙江省椴树蜂蜜体外抑制金黄色葡萄球菌的实验研究

熊亚敏，张伟滨，罗 洋，陈炳坤，吴文忠，姜 波，张锦明*

（1.哈尔滨医科大学附属第一医学院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江省迎春林区人民医院，黑龙江 鸡西 158100）

黑龙江省椴树蜂蜜体外抑制金黄色葡萄球菌的实验研究

熊亚敏1，张伟滨1，罗 洋1，陈炳坤1，吴文忠2，姜 波1，张锦明1*

（1.哈尔滨医科大学附属第一医学院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江省迎春林区人民医院，黑龙江 鸡西 158100）

目的研究黑龙江省不同地区椴树蜜对金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用。方法采用微孔板改良法复制金黄色葡萄球菌模型，将蜂蜜与无菌的培养基（Mueller-HintonBroth培养基）混合后得到5%～50%(w/v)的不同浓度，用不加蜂蜜的无菌培养基和麦卢卡蜂蜜作对照，测定蜂蜜的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）。结果各品种蜂蜜均有抗菌性及杀菌性，但其抗菌及杀菌作用各有不同，其中以迎春椴树黑蜂蜜（MIC为25%，MBC为25%）的抗菌作用较好，相当于麦卢卡15+，其余各类型椴树蜜均具有不同程度的抗菌性作用。结论椴树蜜对于金黄色葡萄球菌有抑菌性和杀菌性，不同地域的椴树蜜对同一细菌具有不同的抗菌活性，其中以迎春地区黑蜂椴树蜜为最佳，为开发和利用蜂蜜作为临床抗菌药物提供了一定的依据。

蜂蜜；最低抑菌浓度；最低杀菌浓度；金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是人体皮肤和鼻腔的常见定植菌，同时也是引起临床感染的常见致病菌，可引起如疖、痈、毛囊炎、甲沟炎等化脓性感染。近年来，由金黄色葡萄球菌所致医院感染的发病率呈上升趋势，其耐药性也逐年增加，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），对β-内酰胺类及其他多种抗菌药物耐药，所导致的各种感染治疗困难，病死率较高，因此逐渐引起临床的重视[1]。作为最古老的甜味剂和健康食品，蜂蜜有很长的食用历史。早在公元前5500年，在埃及/印度和中国的作品中就已提及蜂蜜常用于外敷伤口防治感染[2-3]，国内外开展的研究显示蜂蜜对感染的治疗效果显著[3-5]。黑龙江省内蜂蜜资源众多，是否存在抗菌性的差别也无相关研究。因此，本文旨在选取黑龙江省内不同地区椴树蜂蜜对金黄色葡萄球菌的抑制作用进行研究，对比不同地区的椴树蜜是否存在差别[3，6-7]。

1 材料与方法

1.1 一般资料

金黄色葡萄球菌ATCC25922为哈尔滨医科大学附属第一医学院微生物科提供，将标准菌株接种于营养琼脂平板上37℃、24 h进行复苏传代备用。取24 h细菌转移至无菌的培养基(Mueller-HintonBroth培养基)，经麦氏比浊法调整菌液浓度为0.5麦氏（1×108cfu/mL），并用培养基稀释200倍作为实验浓度（5×105cfu/mL）。

1.2 蜂蜜样本

使用的蜂蜜均为从蜂农手中购买的成熟蜂蜜，并在室温下在黑暗中储存，由蜂农根据地域区域和蜜蜂觅食地点（觅食半径）的花卉鉴定品种，可包括蜂蜜A饶河椴树黑蜂蜜、B迎春黑蜂椴树蜜、C帽儿山椴树蜜、D大青山椴树蜜、E五大连池椴树蜜、F五大连池拜泉椴树、G尚志椴树蜜、H宾县椴树蜜，为了确定我们研究的重现性和可靠性，对照组选择麦卢卡蜂蜜（ComvitaWoundCare，NewZealand）：I麦卢卡15+、J麦卢卡20+。将给类型蜂蜜与无菌的培养基(Mueller-HintonBroth培养基)混合后得到5%、10%、15%、20%、25%、30%(w/v)的不同浓度。所有试管均为涡旋（DigisystemLaboratoryInstrumentsI nc.，台湾），直到均匀混合。充分混合并通过0.2μm过滤过滤器（SartoriusAG，德国）于4℃冰箱保存备用。

1.3 最低抑菌浓度测定

根据参照文献稍作改进[8-9]，将稀释为各实验浓度的蜂蜜溶液应用移液枪加入96孔板中190微升，空白组选择无菌MHB培养基190微升，再向各组加入金黄色葡萄球菌菌液10微升，每组重复三遍，96孔板边缘加培养基后，通过酶标仪检测其600 nm处的数值记为T0，再置于振荡器培养箱（Stuart，UK）以120 rpm，37℃保持24小时，取出测其600 nm处的数值记为T24。算出细菌的抑制率其公式为：抑制率=1-（实验组T24-实验组T0）/（空白组T24-空白组T0）×100%。

1.4 最低杀菌浓度测定

测定从MIC测试中没有细菌生长的每种蜂蜜稀释液。对于没有细菌生长的每个蜂蜜浓度，选择相应蜂蜜稀释液的各孔，并将一个悬浮液从每个孔转移到单独的血琼脂平板（PA板）上。将其均匀铺展并在37℃下孵育24小时。MBC由允许小于1%的细菌生长的最小浓度确定。

2 结 果

2.1 MIC测定结果

不同蜂蜜的抗菌性差异明显，蜂蜜A至蜂蜜J别依次在30%、25%、45%、45%、30%、30%、30%、40%、25%、20%及以上浓度的条件下抑制细菌的生长。因此，各蜂蜜对金黄色葡萄球菌的MIC可由此确定。见表1。

2.2 MBC测定结果

24小时后观察血琼脂平板，蜂蜜A至蜂蜜J别依次在40%、25%、50%、50%、40%、40%、40%、50%、25%、20%及以上浓度的条件下无细菌生长。因此，各蜂蜜对金黄色葡萄球菌的MBC可由此确定。见表1。

表1 黑龙江省内8种蜂蜜和2种麦卢卡蜂蜜对金葡菌的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）

本研究结果显示，不同产地的蜂蜜对同一细菌具有不同的抗菌活性，其中以麦卢卡20+蜂蜜的抗菌作用最好(MIC为20%，MBC为20%)，其次是麦卢卡15+和迎春椴树黑蜂蜜(MIC为25%，MBC为25%)。而入选试验的其他黑龙江省内蜂蜜品种的抗菌作用各有不同，饶河椴树黑蜂蜜、五大连池椴树蜜、五大连池拜泉椴树抗菌性较其他蜂蜜省内稍好，MIC均为30%，MBC均为40%。而宾县椴树蜜的MIC稍差，均为40%，其中宾县椴树蜜的杀菌性（MBC）稍差（为50%），其余蜂蜜抗菌性均为45%。而帽儿山椴树蜜、大青山椴树蜜的抗菌性及抑菌性均稍差（MIC均为45%，MBC为50%）。本研究为体外抗菌敏感性试验，其结果不一定适用于到临床的应用，因为细菌生长环境的不同，以及细菌生物被膜在不同生长环境下导致组成结构的不同等其他因素都可以显著影响蜂蜜的抗菌活性。

3 讨 论

蜂蜜具多种药理功能，其药用价值的开发利用研究已有很长历史。蜂蜜已被证明具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗癌等作用，并可以有效的减少血小板聚集，增强免疫力，并对血管舒张活性有较强作用；此外还具有降压、保护心脏、胃、肝脏等临床价值，蜂蜜的具有抗菌作用与其高渗和含多种酚类化合物，具有较低的pH值等独特的理化性质有关。再有，蜂蜜中含有起抗菌作用的过氧化氢类和非过氧化氢类物质，特别是过氧化氢(Hydrogenperoxide)，通过释放自身的氧原子与病菌细胞中许多酶上的巯基(-SH)结合，使酶失活，干扰细菌的正常代谢，从而起到抗菌作用此外，有些蜂蜜特有的甲基乙二醛(Methylglyoxal，MGO)以及抗微生物肽蜂蜜防卫素-1等成分也是起到抗菌作用的一个原因[2，3，7，10]。

本研究就黑龙江省内多种椴树蜂蜜对金黄色葡萄球菌的影响做初步探讨，结果显示黑蜂椴树蜜在体外能有效抑制经黄色葡萄球菌的繁殖，甚至在25%（w/v）浓度时尚有明显的杀菌性，这与麦卢卡15+的抗菌性相似，为开发和利用蜂蜜作为临床抗菌药物提供了一定的依据。但其具体机制还有待今后进一步的研究。尽管黑蜂椴树蜜可以抑制细菌生长繁殖，但当中有效成分相对复杂，其干预作用很可能是多成分多途径的综合作用结果，目前的研究相对集中在体外实验并不能完全模拟真实的体内作用过程，因此建立体内动物模型，对其进行全组分提取，定向分离，研究不同组分的药效机制，尤其是信号转导等，将成为研究的重点。另外研究结果还有待于进行临床用药试验以确定疗效，同时，随着科学技术的不断发展，对其化学组成、生物药理效应、临床各科应用等方面地深入研究，对医学领域的新老课题进行多角度、立体研究，不断丰富发展，这必将产生巨大的社会效益和经济效益，从而为蜂蜜更广泛的应用开辟了崭新前景。

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Study on inhibition of Staphylococcus aureus in vitro of linden honey in Heilongjiang Province

XIONG Ya-min1， ZHANG Wei-bin1， LUO Yang1， CHEN Bing-kun1， WU Wen-zhong2， JIANG Bo1，ZHANG Jin-ming1*
(1.the First Af fi liated Hospital of Harbin Medical University，Heilongjiang Harbin，150001，China;2.Heilongjiang Province Yingchunlin area the People's Hospital，Heilongjiang Jixi 158100，China)

ObjectiveThe antibacterial effect of linden honey in different areas of Heilongjiang Province on Staphylococcus aureus in vitro.MethodsBy using the improved method of replication of Staphylococcus aureus model，honey and sterile culture medium (Mueller-Hinton Broth medium) mixed 5%～50%(w/v) of different concentrations，compared with sterile culture medium without honey and honey，the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration MIC MBC determination of honey.ResultsAll kinds of honey are antibacterial and bactericidal，but its antibacterial and bactericidal effect are different，of which the spring ting tree black honey (MIC 25%，MBC 25%) of the antibacterial effect is better，the equivalent of medical grade honey Manuka UMF15 +，the rest of the various types of linden tree honey have different degrees of antibacterial effect.ConclusionLinden honey had antimicrobial properties and sterilization to Staphylococcus aureus，different regions have different antibacterial activity of linden honey on the same bacteria，of which spring area black linden honey bee is the best for the development and utilization of honey as clinical antibacterial drugs provided certain basis.

Honey; MIC; MBC; Staphylococcusaureus

R378.11

A

ISSN.2095-8242.2017.060.11688.04

国家临床重点专科建设项目经费资助（2012-649）

张锦明，E-mail：yayamin0000@126.com

本文编辑：吴玲丽