猪圆环病毒2型一步间接免疫荧光试验的建立及初步应用

宫 婷，扈荣良

（1.辽宁省本溪市桓仁满族自治县畜产品安全监察所，桓仁满族自治区 117200；2.军事医学科学院军事兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春 130122）

猪圆环病毒2型一步间接免疫荧光试验的建立及初步应用

宫 婷1，扈荣良2

（1.辽宁省本溪市桓仁满族自治县畜产品安全监察所，桓仁满族自治区 117200；2.军事医学科学院军事兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春 130122）

本研究利用大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）Cap蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，然后将其与FITC标记羊抗兔二抗预混相互作用，制成预混液后与预固定样品（病料或组织细胞）相互作用，通过荧光观察检测PCV2，建立了一步间接免疫荧光试验（one-step indirect immuno fl uorescence assay，OS-IIFA）。应用OS-IIFA和PCR对广东省各地猪场采集的79份病料样品进行检测，阳性率分别为58.23%和69.62%，二者的阳性符合率为80%，阴性符合率为91.66%，总符合率为83.54 %，因此，该方法可作为PCV2流行病学调查及临床监测的有效手段。

猪圆环病毒2型；OS-IIFA；PCR；检测

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，该病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，直径为14～25 nm，基因组为1.7 kb大小的单股负链环状DNA，是迄今发现的最小的动物病毒之一[1,2]。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1和PCV2两型[1,2]。1974年德国科学家首次发现并证实PCV1为猪肾细胞系的一种污染物。虽然猪群中普遍存在PCV-1感染，但它无致病性，不能引起明显的临床症状[3]。而PCV2具有致病性，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），还是猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitisand nephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道疾病复合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）及A2型先天性震颤（congenital tremor，CT）的主要病原[4,5]。同时有资料表明PCV2常与猪呼吸与繁殖综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）等病毒混合感染猪[6-8]。

近年来PCV相关疾病已严重危害我国养猪业，造成巨大的经济损失[9]。因此，建立一种操作简便、成本低廉的快速检测方法，有利于在实际生产和临床中推广，为PCV2的净化和感染防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞、毒株与病料 克隆菌株DH5α感受态购自大连宝生物公司；表达菌株Rosetta感受态为本实验室制备并保存；PK-15细胞为军事兽医研究所流行病学研究室保存；PCV2毒株、PRRSV cc-11株、PRV和猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）为本实验室分离鉴定并保存；确定为PCV2，PRRSV、PRV和CSFV感染的阳性病料组织来自广东省各地猪场79头临床发病猪的肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结样本，本实验室保存。

1.2 主要试剂 质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自爱思进生物技术有限公司；High Affinity Ni-Charged Resin蛋白纯化亲和层析柱购自GenScript公司；Biospin组织基因组DNA提取试剂盒购自BioFlux公司；D-氨基葡萄糖购自Sigma公司；Premix Taq®Version2.0（1.25 U/25 μL）、pMD18-T克隆载体、pET28b表达载体、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、（DL2000）DNA Marker均购自TaKaRa公司；FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京索来宝科技有限公司。

1.3 免疫原的制备及PCV2 Cap多克隆抗体的制备

1.3.1 PCV2 Cap的原核表达与纯化 根据PCV2全基因序列（GenBank登录号：JQ809462.1），利用Primer Premier 5.0设计并合成针对PCV2 Cap基因的引物（小写部分为引入的酶切位点Nco I和Xho I），上、下游引物序列分别为：（CapF）5'- CTAGccatggA CAATGGCATCTTCAACACCCGC -3'和（CapR）5'- ACCGctcgagGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3'，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以PCV2细胞毒为模板，利用PCR技术将缺失核定位序列的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD18T-ORF2，经NcoI、XhoI双酶切后，回收ORF2基因，转移入原核表达载体pET28b的相应位点之间，构成重组质粒pET28b-Cap。将重组质粒pET28b-Cap转化表达宿主菌Rosetta，经终浓度为0.5 mmoL/L的IPTG诱导表达，对以包涵体形式表达的重组蛋白用尿素变性处理后采用High Affinity Ni-Charged Resin蛋白纯化亲和层析柱纯化，并进行SDS-PAGE电泳分析。

1.3.2 免疫程序及PCV2 Cap多克隆抗体的获得 取高度纯化的PCV2 Cap蛋白免疫新西兰大耳白兔（购自长春生物制品研究所实验动物中心）。首免：150 μg纯化的Cap蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分混合乳化后，腹股沟及皮下多点注射；2周后用150 μg纯化的Cap蛋白与弗氏不完全佐剂混合，腹股沟及后腿肌肉多点注射；4周后再次用200 μg纯化的Cap与弗氏不完全佐剂的乳化物腹股沟及后腿肌肉多点注射。大量采血前3 d再次加强免疫，收集血清获得PCV2 Cap多克隆抗体。间接ELISA检测PCV2 Cap多克隆抗体水平。PCV2细胞毒适当稀释后包被ELISA反应板，每孔100 μL，4℃过夜；5%脱脂奶封闭1 h；PCV2 Cap多克隆抗体1:500稀释，37℃作用1 h；加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体1:5000稀释，37℃作用1 h；加入OPD底物缓冲液，避光显色10 min，加2 mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD490。

1.4 检测引物设计 根据GenBank中发表的PCV2全基因序列（GenBank登录号：AF381175.1），设计合成1对特异性鉴定引物，预计扩增片段大小为702 bp。上、下游引物序列分别：（PCV2-F）5'-C GCCACCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACC-3'和（PCV2-R）5'- CGC TTAGGGTTTAAGTG GGGGGTCTTTA -3'，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用高压灭菌超蒸水溶解配成10 pmol/μL，－20℃保存备用。

用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒按使用说明提取病料组织总DNA，并利用合成的PCV2鉴定引物进行PCR检测。反应体系：引物各0.5 μL（10 pmol/μL）、Premix Taq®Version2.0 ( 1.25 U /25μL)13 μL、DNA模板2 μL，加灭菌双蒸水至25 μL。循环参数为：94℃预变性3 min；94℃变性40 s，51℃退火30 s，72℃延伸50 s，扩增30个循环；最后72℃延伸5 min。

1.5 PCV2一步间接免疫荧光试验（one-step indirect immuno fl uorescence assay, OS-IIFA）最佳工作条件的确定

1.5.1 固定液和固定时间的确定 以70%丙酮、80%丙酮、4%多聚甲醛、甲醇-丙酮固定液（1∶1）、100%丙酮做固定，再按照OS-IIFA操作步骤进行，比较不同固定剂和固定时间的固定效果，确定最佳固定条件。

1.5.2 抗PCV2 Cap多抗和荧光二抗OS-IIF染色工作浓度的确定 使用以上述确定的适宜固定液作固定，带毒细胞孔、正常细胞孔、感染猪组织涂片（来自同一个体的肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结制备一张涂片）、阴性猪组织涂片中分别加入不同稀释度的抗PCV2 Cap多抗和阴性血清，血清稀释度分别为1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1000；荧光二抗按说明书稀释，将两者等体积混合，与固定组织或细胞进行一步染色试验，观察比较抗PCV2 Cap多抗和荧光二抗稀释度对试验结果的影响，确定最佳的抗PCV2 Cap多抗稀释度、荧光二抗稀释度和二者的最佳工作比例。

1.5.3 抗PCV2 Cap多抗和荧光二抗共同作用时间的确定 以上述确定的最佳稀释度作为工作浓度， 分别以60、90、120、150 min 作为一抗和荧光二抗共同作用时间，比较不同作用时间对结果的影响，确定最佳的作用时间。

1.6 OS-IIFA敏感性、特异性和重复性试验

1.6.1 OS-IIFA特异性试验 分别将PCV2、PRRSV cc-11株、CSFV 感染细胞，确定为PCV2、PRRSV、CSFV感染的阳性病料组织涂片，进行OSIIFA试验，观察其有无特异性荧光，以确定该方法的特异性。空白对照以PBS代替一抗，观察荧光二抗本身有无非特异性反应。

1.6.2 重复性试验 相同批次的阳性血清和荧光二抗，在确定条件下在不同检验批次对同批样品进行OS-IIFA试验，比较判定结果及荧光强弱的差别，以评价本方法的重复性。

1.7 OS-IIFA对临床疑似PCV2猪组织样品的检测 应用建立的一步间接免疫荧光技术检测临床疑似PCV2感染的病猪组织样本（肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结），同时采用PCR方法对同一病料组织进行病原学检测。将OS-IIFA、PCR检测结果进行比较，进而分析OS-IIFA检测方法的准确性及检测可靠性。

2 结果

2.1 免疫原的制备及PCV2 Cap多克隆抗体的制备

2.1.1 抗原蛋白PCV2 Cap的原核表达与纯化 将构建成功的重组质粒pET28b-Cap经双酶切鉴定及测序鉴定正确后，转化表达宿主菌Rosetta，经终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达，收集诱导前后的菌体进行SDS-PAGE分析（图1）。

鉴定正确后进行大量诱导，采用High Affinity Ni-Charged Resin蛋白纯化亲和层析柱纯化，SDS-PAGE电泳分析显示，获得高纯度的PCV2 Cap抗原蛋白（图2）。Bradford法测定蛋白浓度为1.160 mg/mL。

2.1.2 抗PCV2 Cap多克隆抗体的制备 多次免疫后大量收集血清，获得PCV2 Cap多克隆抗体。将PCV2 Cap多克隆抗体稀释500倍，经间接ELISA检测OD490值为1.08。

图1 重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

图2 重组蛋白pET28b-Cap纯化后SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of puri fi ed recombinant pET28b-Cap proteins

2.2 一步间接免疫荧光试验最佳工作条件的确定

2.2.1 固定液和固定时间的确定 分别以70%丙酮、80 %丙酮、4%多聚甲醛、甲醇-丙酮固定液（1∶1）、100%丙酮作为固定液，分别固定5、10、20 min。根据涂片组织，细胞有无脱落、荧光强度与清晰度来比较，确定细胞采用70%丙酮作为固定液，固定时间10 min；病料组织涂片采用80 %丙酮作为固定液，固定时间20 min效果最佳。

2.2.2 抗PCV2 Cap多抗和荧光二抗OS-IIFA染色工作浓度的确定 以不同稀释度的一抗和荧光二抗混合液进行OS-IIFA染色，结果表明，抗PCV2 Cap多抗稀释度在1:300～1:400之间阳性组织细胞内有明亮绿色特异性荧光，与阴性细胞形成明显的对比，非特异性荧光颗粒很少。再降低稀释度时有少量的非特异性荧光颗粒，而再扩大稀释度时特异性荧光亮度和阳性细胞数量减少，荧光强度由明亮的黄绿色荧光变为清晰但较暗的荧光。

2.2.3 抗PCV2 Cap多抗和荧光二抗共同作用时间的确定 结果表明，抗PCV2 Cap多抗和荧光二抗混合液作用60 min与90 min无明显差别。若作用超过120 min，则非特异性荧光颗粒增加，背景变亮，故一抗作用时间不宜采用120 min。在不影响结果判定的条件下，为了适应快速诊断的需要，最终确定一抗和荧光二抗混合液作用时间采用60 min。

2.3 OS-IIFA敏感性、特异性和重复性试验

2.3.1 OS-IIFA敏感性、特异性试验 未发现其他病毒感染组织细胞与一抗之间有特异性的荧光，证明该方法具有很高的特异性。以PBS 代替抗PCV2 Cap多抗，进行OS-IIFA试验，结果表明抗原与二抗之间无非特异性反应，组织涂片视野内呈深红色背景。

图3 不同病毒感染细胞的OS-IIFA检测结果Fig.3 OS-IIFA results of cells infected with different viruses

2.3.2 重复性试验 对同一病料组织重复涂片，在相同条件下多次进行OS-IIFA检测，判定结果相同，重复性良好。

2.4 OS-IIFA检测法的应用

2.4.1 PCV2感染细胞OS-IIFA检测 在24孔培养板中用10%PCV2同步接种PK-15细胞，同时设未接毒的正常细胞为阴性对照；维持培养72 h后，用70%丙酮固定10 min；弃丙酮，室温晾干，加入用伊文斯蓝-PBS稀释的抗PCV2 Cap多抗和荧光抗体荧光混合液（一抗1:400稀释，荧光二抗按说明书稀释），37℃孵育60 min，用PBST（PBS pH7.2，0.05%Tween-20）洗涤3次，3 min/次；正常PK-15细胞作为阴性对照。荧光显微镜下观察，感染PCV2细胞出现很特异的绿色荧光，荧光灶很清晰，细胞形态很好，细胞背景为暗红色；未接毒的细胞无荧光，背景也是暗红色，结果如图3所示。

图3 PCV2感染细胞的OS-IIFA检测结果Fig.3 Detection of PCV2 in PK-15 cells by OS-IIFA

2.4.2 疑似PCV2感染病料的OS-IIFA检测 将本实验室在广东省各地猪场收集的79份疑似PCV2感染猪的肾脏、脾脏、肺脏和淋巴结样本做涂片，用80%丙酮固定20 min；弃丙酮，室温晾干，加入用伊文斯蓝-PBS稀释的抗PCV2 Cap多抗和荧光抗体荧光混合液（工作浓度：一抗1:300、荧光二抗按说明书稀释），37℃孵育90 min，用PBST（PBS pH7.2，0.05% Tween-20）洗涤3次，3 min/次；同时设正常猪脏器组织作为阴性对照，在荧光显微镜下观察结果如图4所示。

图4 PCV2感染病料的OS-IIFA检测结果Fig.4 OS-IIFA results of PCV2 in tissues from pigs

2.4.3 PCR检测 使用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒，按说明提取79份疑似PCV2感染猪病料组织总的DNA， 用特异性鉴定引物进行PCR检测。0.9%琼脂糖凝胶电泳可见PCR产物条带大小与预期702 bp符合。部分检测结果如下图5所示。

图5 部分疑似PCV2感染病料PCR检测结果Fig.5 The examination of suspicious PCV2-infected samples by PCR

2.4.4 OS-IIFA检测与PCR检测的符合试验 对79份疑似PCV2感染组织同时进行OS-IIFA和PCR检测。用OS-IIFA检测有46份为阳性，33份为阴性；用PCR检测55份为阳性，24份为阴性。这两种方法总符合率为83. 54 %，其中阳性符合率为80% ，阴性符合率为91.66%。

3 讨论

断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的流行已给全球养猪业造成了巨大的经济损失。由于PCV2感染所致的各种疾病的临床表现与病理变化缺乏典型特征，因此这些疾病的临床诊断十分困难，必须借助实验室手段才可以实现确诊，因此迫切需要寻找合适的快速准确的诊断方法，从根本上实现该病的防控和净化[10]。

本研究建立了一种用于PCV2感染细胞和病料组织的OS-IIF检测方法，该方法对传统IIF进行了优化，用伊文斯蓝-PBS稀释的抗PCV2 Cap多抗和荧光抗体混合液进行一步染色，使操作更加省时便捷。对79份疑似PCV2感染组织同时进行OS-IIFA法和传统IIF检测，两者一致率为100%（数据未列出），这表明PCV2 Cap多抗和荧光抗体预混作用存在非特异性结合的可能性较小，至少不会对结果的判定产生影响。在对临床疑似PCV2感染病料的检测应用中，发现该检测方法较适合对脾脏和肾脏组织的检测，阳性样品的检出率较高，可能是由于脾脏和肾脏组织质地较松软，涂片、染色效果较好；PCR检测阳性率较高的淋巴结组织是理论上病毒载量较高的组织，但因其质地坚硬不易制片，OS-IIFA的检出率不及脾脏和肾脏。本研究中，PCR检测方法直接以病料组织（经充分研磨并反复冻融3次处理后）为模板进行扩增检测时阳性率仅为13.9%，需要对病料进行全基因组提取后再进行PCR，检测阳性率为69.62%，相比OS-IIFA检测方法耗时费力，增加了检测成本。同时PCR法敏感性高，常因非特异扩增以及样品交叉污染出现假阳性结果，因此在实际操作中对操作人员要求严格，试验过程要十分小心。本研究中两种检测方法的总体符合率可达83.54%，阳性符合率为80%，阴性符合率为91.66%，在实际应用中可以根据试验目的和要求，结合技术和设备条件，选择适宜的检测方法或将上述两种检测方法结合应用，做到早发现，早控制，为PCV2的防控提供技术支撑[11]。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF ONE-STEP INDIRECT IMMUNOFLUORESCENT ASSAY FOR DETECTION OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 INFECTION

GONG Ting1, HU Rong-liang2

(1. Huanren City Bureau of Livestock Product Safety Supervision, Huanren117200,China; 2. Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Military Academy of Medical Sciences, Institute of Military Veterinary, Changchun 130122, China)

In this study, the capsid protein of Porcine circovirus type 2(PCV2) was expressed in E.coli and used as antigen to immunize rabbits for preparation of polyclonal antibodies. Then the polyclonal antibodies were mixed and bound to the FITC conjugated goat antirabbit antibodies. The mixtures were applied to fixed samples（tissue slides and cells）. This one-step indirect immunofluorescence assay (OS-IIFA) developed here was used to detect the PCV2 antigen in 79 clinical samples collected from porcine farms in Guangdong province and compared with classical PCR method. As a result, the positive rates of these two methods were 58.23 % and 69.62 %,respectively, suggesting the OS-IIFA might be used for PCV2 epidemiology survey and diagnosis.

Porcine circovirus type 2; OS-IIFA; PCR; detection

S852.659.2

A

1674-6422（2017）05-0011-06

2016-11-08

公益性行业（农业）科研专项（201203056）

宫婷，女，硕士，主要从事畜产品安全检验监测

扈荣良，E-mail：Ronglianghu@hotmail.com