猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达

吴思敏，王钊哲，许 瑞，林矫矫，洪 炀，陈兆国，陆 珂，李 浩，石耀军，江嘉欣，李嘉静，朱传刚，唐亚兰

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部寄生虫学重点开放实验室 国家防治动物血吸虫病专业实验室，上海200241；2. 韶关学院英东生命科学学院，韶关512000）

猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达

吴思敏1,2，王钊哲1，许 瑞1，林矫矫1，洪 炀1，陈兆国1，陆 珂1，李 浩1，石耀军1，江嘉欣1,2，李嘉静1,2，朱传刚1，唐亚兰1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部寄生虫学重点开放实验室 国家防治动物血吸虫病专业实验室，上海200241；2. 韶关学院英东生命科学学院，韶关512000）

为获得可用于诊断的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E2蛋白重组抗原，对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与pET-28a(+)载体连接后，转化至宿主菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性，His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp，PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符；重组蛋白为可溶性表达，大小约23 kDa； Western blot结果显示，重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合，具有良好的免疫反应性，可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。

猪瘟病毒；E2基因；原核表达；蛋白纯化

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）是一类具有包膜的小型RNA病毒，属于黄病毒科，瘟病毒属[1]。猪瘟是一种高度传染性疾病，后期常伴有伤寒及巴氏杆菌病继发，一年四季都有发生，以春夏多雨季为多。因其高传染性给养猪业造成了巨大的经济损失，长久以来一直是养猪业的重要威胁[2]。

CSFV编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞酶的作用，形成4个成熟的结构蛋白（C、Ems、El和E2）以及至少7个非结构蛋白。E2在猪瘟病毒多聚蛋白上的位置始于氨基酸残基690，终止于氨基端残基1060，长约370个氨基酸。E2是CSFV主要的保护性抗原蛋白。CSFV依靠E2蛋白吸附和进入敏感细胞，能诱导机体产生高滴度的中和抗体，抵抗致死剂量的攻击，而缺乏该蛋白的猪瘟病毒则不能诱导机体产生中和抗体。鉴于此，E2蛋白成为近年来血清学诊断抗原的主要对象[3]。

本研究对E2蛋白的主要抗原结构域的特点进行了分析，将优化后的E2基因克隆至pET-28a(+)，转化到大肠杆菌进行重组表达并纯化，Western blot分析重组蛋白的免疫原性，从而为建立一种快速、灵敏的以CSFV-E2为诊断抗原的检测技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 生物材料 大肠杆菌BL21（DE3)，质粒pET-28a(+)由上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室保存。

1.2 主要试剂 BamH I、Hind III、10×QC·G·Buffer、TaKaRa BCA 蛋白检测试剂盒购自TaKaRa生物技术公司；T7通用引物购自上海华津生物技术有限公司；Axygen质粒小量提取试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生物科技（北京）有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Whatman公司；羊抗猪IgG购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 重组猪瘟病毒E2主要抗原结构域基因的构建合成 根据GenBank中猪瘟病毒E2蛋白的基因序列，分析表达蛋白的主要B细胞抗原表位，找出主要抗原表位结构域及对应的基因序列，将多个抗原表位用不含支链的丙氨酸等串联，在重构的基因序列3'端加入TAA的终止序列，并分别在5'和3'端添加内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ位点。基因序列分析密码子偏向性并将稀有密码子替换成大肠杆菌偏好密码子，送至苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4 重组质粒的连接、转化 将目的基因连接到pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-28a(+)-E2，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单个菌落培养后进行扩大培养，分别采用菌液PCR、抽取质粒双酶切和测序方法对重组质粒的准确性进行鉴定。

1.5 重组质粒的表达及溶解性分析 将测序正确的含有重组质粒pET-28a(+)-E2的宿主菌BL21(DE3)接种于含 Kan+的LB液体培养基中，置于37℃培养箱中，250 r/min振荡培养至细菌生长对数期（OD600约为0.6）。加入IPTG诱导，分别于诱导前，诱导后1、2、3、4、6、8 h时，各取菌液1 mL，进行SDSPAGE电泳鉴定，观察最佳诱导表达时间。

将诱导后的菌液8000×g离心15 min，收集菌体沉淀。用PBS重悬，反复冻融3次后，冰浴超声破碎20 min。将超声后的菌液4℃、8000×g离心15 min，收集上清与沉淀，沉淀溶于8 mol/L尿素，同样条件离心收集上清。分别取超声后上清和沉淀溶解上清，用SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。

1.6 重组蛋白的纯化 根据SDS-PAGE分析的重组蛋白表达形式，采用His·resin Bind树脂柱层析的方法纯化目的蛋白，收集各段时期的蛋白流出液，并进行SDS-PAGE分析重组蛋白的纯化效果；将纯化后的重组蛋白用1×PBS透析，除去溶液中的咪唑。

1.7 Western blot检测重组蛋白的免疫原性 将纯化透析后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，在冰浴条件下，将重组蛋白电转移至硝酸纤维素膜上；用5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h后，PBST洗3次，每次10 min；然后1:100稀释的猪瘟阳性血清作为一抗，37℃孵育2 h，同样方法洗涤；以羊抗猪IgG（1:3000稀释）为二抗，37℃孵育1 h，同样方法洗涤后，HRP-DAB显色试剂盒显色，分析重组蛋白免疫原性。

2 结果

2.1 重组质粒菌液PCR、双酶切及测序鉴定 将构建的重组质粒进行菌液PCR、双酶切及测序鉴定，结果显示菌液PCR片段大小约750 bp（含部分载体序列），双酶切后目的基因大小约500 bp，与构建的目的基因大小相符，测序结果与目的基因序列一致。

图1 重组质粒PET28a(+)-E2的鉴定Fig.1 Identi fi ed the recombinant plasmid PET-28a(+)-E2

2.2 E2蛋白主要抗原结构域基因序列 猪瘟病毒E2蛋

白全长约370个氨基酸，通过分析E2蛋白的B细胞抗原表位，将主要抗原表位进行基因重构后的序列长486 bp，预测表达一全长161氨基酸的蛋白。测序结果和预测相符，见图2。

图2 重构的E2蛋白抗原表位基因序列（含两个酶切位点序列）Fig.2 Reconstruction of antigen epitope gene sequence of E2 protein

2.3 重组蛋白的原核表达与可溶性分析 经SDSPAGE分析显示，pET-28a(+)-E2经IPTG诱导后成功表达，在约23 kDa处有清晰的目的条带，诱导1 h后表达量达到最高且趋于稳定，重组蛋白rE2约占菌体总蛋白的10%（图3）。对蛋白溶解性进行分析，结果显示该重组蛋白rE2为可溶性蛋白（图4）。

图3 pET-28a(+)-E2表达时相Fig.3 Phase expression of PET-28a(+)-E2

图4 重组蛋白rE2溶解性分析Fig.4 Solubility analysis of rE2 protein

2.4 重组蛋白rE2的纯化 取表达1 h的菌液裂解物上清，经Ni-NTA His Bind Resin 树脂纯化，获得了较纯的重组蛋白（图5），目的蛋白条带约23 kDa。

2.5 Western blot检测重组蛋白的免疫原性 用人工感染猪瘟的猪血清进行Western blot，在约23 kDa处出现印迹条带，证实重组蛋白具有免疫原性（图6）。

图5 重组蛋白纯化结果Fig. 5 Puri fi cation result of rE2 protein

图6 重组蛋白的免疫原性分析Fig.6 Analysis of pET-28a(+)-E2 immunogenicity by Western blot

3 讨论

猪瘟是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱，是威胁养猪业的主要传染病之一。它不仅是临床上最常见的猪病，而且经过多年的防治仍会发生，很难根除。治疗猪瘟最有效的方法需要及时准确的诊断，目前可通过免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验法、血清中和试验、琼脂糖凝胶沉淀试验等进行检测。传统的猪瘟病毒检测均以猪瘟病毒野毒株或弱化毒株的细胞培养物等作为诊断抗原，而这些完整的全毒株的纯化过程价格昂贵，操作繁杂、成本较高，为猪瘟病毒的临床检测带来阻碍。

E2是CSFV的主要保护性抗原蛋白，在体外E2蛋白可诱导机体产生病毒中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV攻击的抗体。E2蛋白由多聚蛋白的Arg690至Leu1060之间的370个氨基酸残基组成，位于病毒囊膜表面，参与病毒的感染过程。Wensvoort等[4]研究表明E2蛋白表面单抗决定簇可以分为4个抗原结构域，命名为A、 B、C、D。4个抗原结构域都位于E2蛋白N端690～866位氨基酸之间，而866位氨基酸以后的结构不参与抗原结构域的形成，所以690～866位氨基酸是E2蛋白最具有抗原性的部分[5]（图7）。A1、A2、A3三个亚结构抗原结构域组成了A抗原结构域。A1、A2区域比较保守，其他区域不保守。A抗原区位于766位氨基酸与866位氨基酸之间，保守的A1与A2亚区位于795位氨基酸与851位氨基酸之间，B抗原结构区位于690位氨基酸与733位氨基酸之间，C抗原结构区位于690位氨基酸与800位氨基酸之间，D抗原结构域位于766位氨基酸与800位氨基酸之间[6]。Zhou等[7]通过研究E2蛋白的这些区域的B细胞抗原表位，证明其具有良好免疫保护力。

图7 E2蛋白基因结构图Fig.7 The structure diagram of E2 protein

鉴于E2蛋白的特性，E2蛋白常作为临床上的诊断抗原。E2蛋白分子量较大，含有一些非抗原表位的结构域，可能增加诊断的非特异性，而且研究表明E2糖蛋白的C端有一段含有约30个氨基酸残基组成的跨膜区（transmembrane region，TMR)，很难在大肠杆菌中得到可溶性表达。近年来，张永国等[8]学者利用猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构表位域表达纯化作为诊断抗原，但结果多为包涵体表达，在复性过程中加入的变性剂和去垢剂等易引起蛋白的不可逆修饰及性质的改变，甚至有些纯度较低。本研究从GenBank中搜索E2蛋白的相关基因序列，分析表达蛋白包含的B细胞抗原表位，将11个较为集中的抗原表位分别用两个丙氨酸连接，重构了表达E2蛋白抗原表位的基因序列。

影响外源基因表达水平的因素很多，密码子的选择可能是影响表达的参数之一。尽管大多数氨基酸的遗传密码子是简并的, 但在原核和真核基因上简并密码子的使用并不是随机的, 基因表达水平与嗜好密码子的使用程度之间存在强的相关性。为了在原核表达系统中表达E2蛋白抗原表位的基因，本课题尝试优化密码子序列以提高表达水平。

通过密码子优化的表达E2蛋白抗原表位的基因序列，成功的构建了原核表达质粒并在宿主菌获得了可溶性表达。表达目的蛋白占全菌蛋白的10%。由于目的蛋白存在于细菌裂解物的上请中，方便采用亲和层析进行蛋白纯化。但在亲和层析时，部分目的蛋白被缓冲液洗脱，在洗脱液中依然保持大量的目的蛋白。

重组多表位抗原的原核表达不仅实现了蛋白的简单纯化，而且表达量稳定，降低了重组抗原的生产成本，同时改变了以CSFV野毒株或弱化毒株的细胞培养物等作为诊断抗原的危险性。对表达产物的抗原性分析表明，重组蛋白E2能与CFSV阳性血清发生特异性反应，保留了E2蛋白良好的免疫原性，为后续建立与完善猪瘟抗体检测奠定了坚实的基础。

[1] Fauquet C M, Mayo M A, Maniloff J, et al .VirusTaxonomy: The Eighth Report of the International Commit tee on Taxonomy of Viruses [M]. San Diego,Calif: Elsevier Academic Press, 2005.

[2] Ansari I H, Kwon B, Osorio F A, et al. Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity,antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies[J]. J Virol, 2006, 80(8): 3994-4004.

[3] 孙元, 夏照和, 梁冰冰, 等. 基于重组E2蛋白的猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国兽医科学,2008, 38(4): 315-319.

[4] Wensvoort G. Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies[J]. J Gen Virol, 1989,70(Pt11) : 2865-2876.

[5] 苏佰通. 抗猪瘟病毒疫苗效力免疫监测方法的建立及应用[D].长春: 吉林大学, 2014.

[6] 王莹, 任向阳, 张昶, 等. 猪瘟病毒分子生物学研究进展[J].上海畜牧兽医通讯, 2006(2): 8-11.

[7] Zhou B, Liu K, Jiang Y, et al. Muliple linear B-cell epitopes of classical swinefever virus glycoprotein E2 expressed in E.coli as multiple epitope vaccine induces a protective immmunne response[J]. Virol J, 2011, 8: 378.

[8] 张永国, 刘湘涛, 韩雪清, 等. 猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达[J]. 畜牧兽医学报, 2004, 35(2): 182-185.

CLONING AND EXPRESSION OF SURFACE ANTIGEN E2 OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

WU Si-min1,2, WANG Zhao-zhe1, XU Rui1, LIN Jiao-jiao1, HONG Yang1, CHEN Zhao-guo1, LU Ke1,LI Hao1, SHI Yao-jun1, JIANG Jia-xin1,2, LI Jia-jing1,2, ZHU Chuan-gang1, TANG Ya-lan1

(1.Natural Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Key Laboratory for Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. YingDong College of Life Science, Shaoguan University, Guangdong,Shaoguan 512000, China)

In order to obtain recombinant E2 protein of Classical swine fever virus (CSFV), B cell antigen epitope was re-constructed and expressed in E. coli. The recombinant gene sequence was cloned into pET-28a(+) and inserted into BL21(DE3), The recombinant fusion protein was expressed with induction of IPTG and puri fi ed using Ni-NAT His·Bind Resin. Results showed that the reconstructed gene for multiple antigen epitope were about 500 bp, which was consistent with the results of PCR and double restriction digestion. Recombinant protein was soluble and molecular weight was about 23 kDa. Western blot showed that the recombinant protein reacted with positive swine fever antiserum. The recombinant protein may be used to develop diagnostic assays for swine fever.

Classical swine fever virus; E2 gene; prokaryotic expression; protein puri fi cation

S852.651

A

1674-6422（2017）05-0032-05

2017-01-19

国家重点研发计划（2017XFD0501306）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2017JB20）

吴思敏，女，生命科学专业

朱传刚，E-mail: zcg@shvri.ac.cn