汉滩病毒糖蛋白免疫反应性表位研究进展

孙报增，秦聪聪，康文龙，陈隆宇，谢明阳，毛自蕊，姜东伯，杨 琨

1 概 述

汉坦病毒（Hantaviruses, HV）是属于布尼亚病毒科正汉坦病毒属的负性RNA病毒，同时分为新、旧世界HV，前者包括引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS（又称流行性出血热）的汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）、首尔病毒（Seoul virus, SEOV）、多布拉瓦-贝尔格莱德病毒、普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）; 后者包括引起汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）的安第斯病毒和辛诺伯病毒[1]。HFRS的主要临床特征是肾功能障碍和出血，而HPS的特征是急性呼吸衰竭。在中国，HFRS仍然被认为是严重的公共卫生问题，每年约有20 000～50 000例患者，病死率约为3%～10%[2]。

HTNV基因组由3个负链RNA片段组成：大（L）、中（M）和小（S）片段，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）和核衣壳蛋白[3]。汉坦病毒GP是一个保守序列，宿主蛋白酶切割该序列产生N-末端糖蛋白（glycoprotein N-terminal, Gn）和C-末端糖蛋白（glycoproteinC-terminal, Gc）[4]，而Gn和Gc已被证明是保护性中和抗体反应的主要靶标[5]。HTNV灭活疫苗存在免疫反应不理想、保护作用不足等问题，甚至可能引起各种安全问题[6]。如今，研究更多基于HTNV GP的免疫反应性，借此来设计出强保护效力的新型HTNV疫苗。

表位是存在于抗原表面的、决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团，又称为抗原决定簇。抗原通过抗原表位与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答。因此，表位是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应特异性的基础，其数量、性质和空间构型决定着抗原的特异性。近年来，国内外学者发现了HTNV GP上表位的重要性，对其展开了充分且有意义的研究。在此，本文对近年来国内外关于HTNV GP表位的研究进展进行简要总结。

2 HTNV GP优势表位的研究方法

2.1 通过鉴定T细胞抗原表位多肽活性来筛选表位 近年来，为了筛选鉴定HTNV GP上的T细胞表位，常用酶联免疫斑点试验（enzyme linked immunospot assay, ELISpot）来检测T细胞表位多肽活性，从而确定活性较高的表位即优势表位。ELISpot可以在单细胞水平对抗体分泌细胞（antibody secreting cell, ASC）及细胞因子（cytokines, CK）分泌细胞进行检测，是细胞免疫学研究中高敏感性的检测方法，可以从20万～30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。同时，该方法能够对抗原刺激后的活细胞进行功能性检测。因其具有较髙的特异性、直观可信度，并且易操作，所以被广泛用于CK分泌细胞检测或ASC测定中，在国际学术界也获得了广泛的认可[7]。Ma等[8]将HTNV GP上全部氨基酸序列合成281个表位，并且根据顺序分成28个肽库，用来刺激HFRS患者的外周血单个核细胞，然后对高活性肽库中15肽表位进行单个表位的ELISpot分析，进一步筛选出20个免疫表位，即优势表位。Jiang等[9-11]通过ELISpot对其新型靶向DNA疫苗细胞保护性免疫效力进行评价，同时鉴定出aa470-484 等多个9肽和15肽表位为优势表位。

另一方面，对于免疫信息法筛选得出的表位，同样可以鉴定其多肽活性来进行实验验证。Sun等[12]及Tang等[13]使用ELISpot对预测的优势表位进行了验证，证明了方法的可靠性以及细胞免疫反应性表位的有效性。Ma等[14]通过对不同表位肽疫苗组进行ELISpot来鉴定表位肽作为疫苗的有效性。

2.2 应用免疫信息学预测法来筛选T细胞表位 由于生物信息学的飞速发展，其在免疫表位上的应用研究更多的被开发出来。T细胞表位的预测研究始于对辅助性T细胞（helper T cell, Th）表位的预测，但对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）表位预测的探索进展最快，研究最深入，预测最成功[15]。

目前，对Th表位和CTL表位亲和力的预测，均有多个预测网站根据不同算法对HTNV GP表位的亲和力进行预测评估。其中，CTL表位的预测多使用IEDB-recommended[16]（http://tools.iedb.org/mhci/）、SMMPMBEC[17]（http://tools.immuneepitope.org/mhci/）、NetMHCpan4.1[18]（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/）、SYFPEITHI[19]（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm） 以 及Rankpep[20-21]（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）等预测网站进行亲和力分析；Th表位的亲和力预测多使用IEDB[16]（http://tools.iedb.org/mhcii/）、NetMHCIIpan3.2[22]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2）、SYFPEITHI[19]（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm） 和Rankpep[20-21]（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）等预测网站。Sun等[12]预测在高频人群HLA基因型中GP全长中9肽和15肽的免疫亲和力，使用上述多个网站多种算法评估亲和力，选择共有的高亲和力表位，从而增加亲和力预测的准确性。

然而，高亲和力表位不一定具有强免疫原性，Vaxijen-2.0[23]（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）工具可以对肿瘤、病毒和细菌抗原进行免疫原性的预测。通过使用该工具，筛选出一批强免疫原性的抗原表位。

HTNV自从被发现以来，在欧亚大陆的不同地区已经发现众多变异株。BLASTP （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）工具可以对给定抗原在一定范围内进行种间种内保守性评估。ClustalX2.1工具也可以对不同毒株的糖蛋白序列进行比对，通过WebLogo对结果进行呈现。Sun等[12,24]在其研究中将HTNV 76-118株与137种变异株的高亲和力区段进行比对，展现了部分GP表位上的高频率突变位点。

通过以上免疫生物信息学的分析，最终获得高亲和力、强免疫原性和种间种内保守的优势表位。免疫原性分析及保守性分析，成功筛选出高亲和力、强免疫原性和种间种内保守的HTNV GP上9肽和15肽优势表位[12，24]。使用该预测分析程序，能够降低单一亲和力算法所带来的误差，免疫原性分析使筛选出的抗原肽具有强免疫原性，同时保守性分析能够使筛选的表位具有广泛变异株适用性，从而筛选出具有广泛地区人群适用性的HTNV GP表位。

2.3 表位肽扫描技术和噬菌体展示肽库技术用于探索B细胞表位 上述方法在发现HTNV GP的T细胞表位中已得到充分使用及推广。由于HTNV的清除依赖于细胞免疫的功能，因此过去数十年间大多数研究注重于针对T细胞表位。而体液免疫功能在长期免疫中起着重要的作用[25]。因此，早期部分学者将研究方向放在B细胞表位上以探究增强HTNV感染后的体液免疫，从而达到对HTNV感染长期免疫的效果。

表位肽扫描技术（peptide scanning technique,Pepscan）是研究B细胞表位的主要方法，利用合成肽对蛋白质进行表位作图，即已知蛋白质抗原分子的基因序列，合成或表达连续的重叠短肽，通过与相应的单克隆抗体（单抗）或多克隆抗体（多抗）反应，分析检测结果以确定相应的抗原表位[26]。Yan等[27]使用Pepscan方法绘制了3D8单克隆抗体识别的GP表位，并且通过竞争性ELISA方法进一步证实了与3D8单克隆抗体结合的特异性。

早期研究还使用噬菌体展示肽库技术来研究HTNV GP 中表位的体液免疫反应。其基本原理是将外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列，并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用来筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术[15]。具体过程为将单抗包被至聚乙烯平皿后，加入噬菌体展示肽库，使其与单抗充分反应后，洗去未结合的游离噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来。将其浸染宿主大肠杆菌进一步扩增后回收，再进行下一轮筛选。通常经过3～4轮的筛选，并且每次增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，即能推知该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定该单抗所针对的抗原表位。该方法已得到Wang等[28]的充分验证，证明其能够模拟HTNV抗原的表位，且表位的体液免疫反应性显著增强。 Xin等[29]从噬菌体展示肽库中鉴定出HTNV GP受体结合域的寡肽3G1。Larson等[30]使用该方法鉴定出中和表位，证明其通过β3整联蛋白抑制HTNV的进入从而起到抗病毒作用。

2.4 肽-MHC四聚体技术 指将生物素标记在底物肽的赖氨酸残基上，使得一个标记荧光素的链亲和素与4个生物素标记的肽-MHC复合物结合形成四聚体，肽-MHC四聚体与抗原特异性的T细胞上的T细胞受体（T cell receptor, TCR）结合后，即可以通过流式细胞仪定量检出体内抗原特异性CTL。这项技术通过对表位与T细胞特异性识别结合从而完成对表位的验证，具有高灵敏性、高特异性和高稳定性等优点。Tang等[13]通过预测优势表位后，合成表位肽-HLA-A*0201四聚体。染色结果发现，各表位特异性CD8+T细胞频率在轻度HFRS患者中较高，提示HTNV感染后预测的表位可诱导保护性免疫反应。

3 HTNV GP优势表位的应用研究进展

3.1 鉴定出具有细胞或体液免疫反应性/免疫反应性的表位 通过上述方法与研究，鉴定出一批具有强反应性、T/B细胞特异性的HTNV GP优势表位，将T、B细胞优势表位的氨基酸序列及鉴定方法进行整理汇总，如表1和表2所示。由此发现关于B细胞表位的研究较T细胞少，这可能与下面几点相关：①约90% B细胞表位是构象表位，同时构象B细胞表位不一定来自连续的肽段[31-32]；②线性B细胞表位通常引发不与天然抗原交叉反应的抗体[32]；③ T、B细胞在发育过程中经过V、D、J基因片段的重排从而形成TCR库和B细胞受体（B cell receptor repertoire,BCR）库[33]，肽-MHC的结合形成了TCR库，个体携带的特定MHC等位基因组成为TCR库多样性的来源[34]；而B细胞必须对大量外来抗原产生反应并且无TCR相似的限制性[35]，因此BCR库进化出相当大的数量。

表1 B细胞优势表位汇总Table 1 Summary of dominant B cell epitopes

表2 T细胞优势表位汇总Table 2 Summary of dominant T cell epitopes

续表2

用不同方法得到的优势表位结果存在部分氨基酸序列交叉，提示各种研究方法可互相证明其有效性。在T细胞表位研究中，生物信息学法分析表位结合ELISpot验证所得到的优势表位具有较高的可信度。同时，由于优势表位并不是均匀分布的，由此可以得到GP免疫反应性热点区域：B细胞优势表位GP免疫反应性热点区域为：aa443-466；T细胞优势表位GP免疫反应性热点区域为：aa21-39、aa145-180、aa193-211、aa257-303、aa445-484、aa622-632、aa737-765、aa781-799、aa805-851、aa933-947、aa961-979 和 aa1082-1098。每个热点区域至少包含2个优势表位，提示对热点区域进行研究能够更快速的分析出强免疫反应性表位。

3.2 表位的保守性研究 近期有研究报道了中国不同地区HTNV的遗传多样性和系统发育特征[36-37]，并且HTNV变异株的增加和传播受啮齿动物的数量和活动影响[38-39]。而表位的保守与否直接关系着其免疫效力的发挥，引起病毒免疫反应的保守表位可以增加保护性免疫的范围。因此，表位特异性种间和种内保守性研究不仅检查其对HTNV的反应性，还检查了对不同种HV的交叉反应性[24]。Sun等[24]将保守性分析纳入分析优势表位的内容之一，对HTNV 76-118株的GP表位种间和种内保守情况进行探究。发现9肽表位的保守性较差，而15肽表位的保守性较为良好[12]。这可能与15肽表位与MHC-II类分子结合的灵活性有关。在此基础上，通过比对HTNV 147种变异株GP氨基酸序列，对高亲和力区域进行进一步的保守性分析，推导出在众多HTNV 变异株中存在高频率变异位点的表位的亲和力更好，提示变异使表位的免疫反应性增强[12]。

3.3 种属交叉反应性的探究 对HTNV 研究只能在感染病例和实验动物之间进行，因此人们探究病毒抗原的种属交叉免疫反应性旨在寻求一种可模拟出人体免疫反应的实验动物。通过对亲和力数据进行聚类分析后，有研究分别探索了15肽和9肽抗原的跨种属交叉免疫反应性，均发现Balb/c小鼠对HTNV GP的免疫亲和力和人的更相近，提示缺乏人源化HLA转基因小鼠的情况下，Balb/c小鼠可能是研究实验的有效替代物[12，24]。

3.4 优势表位 用来疫苗研究以增强特异性体液或细胞免疫灭活HFRS疫苗已在亚洲广泛用于人群接种，然而，在中和抗体效价、细胞免疫应答和长效免疫记忆方面存在不足，不能完全防止人类感染HTNV[40-42]。已有研究利用所发现的表位进行疫苗研究以特异性增强机体抗HTNV的能力。

Zhao等[43]构建了抗HTNV、SEOV和PUUV感染的多表位嵌合DNA疫苗，该合成基因编码了25个显性B细胞和T细胞表位，证明可诱导显著的体液免疫和细胞免疫。Ma等[44]利用表位肽直接作为疫苗，对小鼠进行免疫后评价免疫保护效力，发现肽疫苗可诱导强烈的IFN-γ应答和有效的细胞毒性T细胞应答，证明肽免疫小鼠对HTNV的攻击具有部分保护作用。Tang等[13]也利用发现的表位辅以佐剂形成疫苗，对HLA-A2.1/KbTg转基因小鼠进行免疫程序，成功地建立了保护性CTL应答。上述研究有效的解决了现有灭活HFRS疫苗存在的问题，同时为新疫苗的研发提供了新的思路。

4 结 语

抗原表位是机体特异性免疫反应的基础，利用抗原表位来设计疫苗已被认为是一种可行、有效且安全的策略。近年来，生物信息学策略得到充分运用，不仅在HTNV等出血热病毒上得到充分运用[45-48]，对于广泛流行的新型冠状病毒也已有文章发表[49-52]。然而，由于机体内免疫应答机制的复杂性，使得鉴定的抗原表位不能完全反应体内的实际情况。同时，各个研究方法并没有统一的标准，以及每个生物信息学算法上存在的缺陷[53]，使得获得的优势表位的免疫反应性结果还有待商榷，“新抗原的发现和验证仍然是一个令人生畏的问题”[54]；而对于优势表位发现后续的研究，似乎进入了一个“死胡同”，并没有将表位展开进一步应用。现有另外多项新型表位研究方法在其他领域已得到广泛应用，如基于流式细胞术的细胞内细胞因子染色法，已应用于SARS-CoV-2表位[55]和癌细胞表位[56]等研究。因此，建立一套行之有效的用于生物安全防护和公共卫生领域的病原体表位评价体系迫在眉睫。利用各种预测评价方法获得具有免疫反应性的优势表位，可充分应用于疫苗研制、药品开发、临床诊断等领域。相信在各个领域的协同配合下，HTNV GP表位终将在预防和治疗汉坦病毒上发挥出巨大价值。