超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白工艺优化

孔祥佳 - 吴秋莹 - 谢 勇 林 埔 刘智禹 -

(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2. 福建省水产研究所，福建 厦门 361013) (1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 2. Fisheries Reasearch Instiute of Fujian, Xiamen, Fujian 361013, China)

超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白工艺优化

孔祥佳1KONGXiang-jia1吴秋莹1WUQiu-ying1谢 勇1XIEYong1林 埔1LINPu1刘智禹2LIUZhi-yu2

(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2. 福建省水产研究所，福建 厦门 361013) (1.CollegeofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian350122,China; 2.FisheriesReasearchInstiuteofFujian,Xiamen,Fujian361013,China)

采用单因素试验和响应面法确定坛紫菜藻红蛋白提取的最佳工艺条件。通过单因素试验探讨加酶量、超声时间、超声功率、pH、固液比对藻红蛋白得率和纯度的影响，并根据单因素试验结果固定pH为5.0、固液比为1∶40 (g/mL)，同时选取加酶量、超声时间和超声功率为影响因素进行响应面优化试验，确定坛藻红蛋白的最优提取工艺参数为：加酶量0.05 g、超声时间40 min、超声功率为额定功率的90%(450 W)。该条件下藻红蛋白的得率和纯度分别为(1.808±0.007)%和0.460±0.001。

坛紫菜；藻红蛋白；超声波；纤维素酶

海藻中含有丰富的参与光合作用的捕光色素，主要包含叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白[1]。藻胆蛋白是一种水溶性捕光色素蛋白，按其最大特征吸收峰和呈色类型不同，又分为藻红蛋白(phycoerythrins，PE；λmax=540～570 nm；紫粉色)、藻蓝蛋白(phycocyanins，PC；λmax=610～620 nm；蓝色)、别藻蓝蛋白(allophycocyanins，APC；λmax=650～655 nm；蓝绿色)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanins，PEC；λmax=560～600 nm；橙色)四类[1][2]1。其中，对藻红蛋白的研究最多，并已广泛运用于食品色素添加剂[3-4]、荧光探针[3-4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[5]等生物医学工程领域。紫菜是世界上分布较广的大型经济海藻之一，含有丰富的藻红蛋白，可为提取分离藻红蛋白提供优质的原材料[2]3-4,12[6-7]。在藻红蛋白的分离技术中，合理有效地破碎原材料细胞膜和细胞壁结构尤为重要，已报道的提取方法有酶解法[6,8]、超声波法[7]、溶胀法[7,9]、反复冻融法[7,10]等。但施瑛等[6]所采用的复合酶法提取紫菜藻红蛋白需耗时7.2 h；何思佳等[7]对比溶胀法及反复冻融法提取条斑紫菜藻红蛋白分别耗时1 440 min 和120 min×5次，且提取率低。而超声波法是利用超声波的空化效应和机械作用破碎原材料的细胞膜和细胞壁结构，具有提取率高、提取时间短等优点[7,11-14]。同时，纤维素酶利用酶催化反应的专一性降解原材料细胞壁中的纤维素从而破坏细胞壁结构，具有提取率高、提取温度低等优点。但目前将二者结合用于紫菜藻红蛋白提取的报道较少。本试验拟以福建省广泛分布的坛紫菜(Porphyrahaitanensis)为试材，采用超声波协同纤维素酶提取坛紫菜中的藻红蛋白，利用响应面法对提取工艺进行优化，以期为开展坛紫菜有效物质研发及藻红蛋白大规模生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

坛紫菜：福建省水产研究所；

纤维素酶：10 000 U/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

浓盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

台式离心机：TDL80-2B型，上海安亭科学仪器厂；

恒温水浴锅：KD-600S型，上海精宏实验设备有限公司；

电子分析天平：CP144型，上海奥豪斯仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV9100型，北京瑞利分析仪器公司；

中药粉碎机：FW177型，天津市泰斯特仪器有限公司；

数控超声波清洗器(额定超声功率为500 W)：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司；

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

磁力加热搅拌器：CJJ79-1型，金坛市白塔新宝仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 藻红蛋白提取工艺流程

坛紫菜干→粉碎→过筛(60目)→按比例加入蒸馏水→调pH→添加纤维素酶酶解→超声波提取→离心→取上清液→检测藻红蛋白得率和纯度

1.3.2 坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的测定 参照施瑛等[6]的方法，按式(1)、(2)计算坛紫菜藻红蛋白的得率和纯度。

(1)

式中：

ρPE——提取稀释液中藻红蛋白的质量-体积浓度，mg/mL；

A560 nm、A617 nm、A650 nm——提取稀释液在560，617，650 nm 的吸光值；

W——藻红蛋白得率，%；

n——稀释倍数；

VPE——提取液的体积，mL；

MPE——坛紫菜干品的质量，g。

(2)

式中：

P——藻红蛋白纯度；

A280 nm、A560 nm——提取稀释液在280，560 nm的吸光值。

1.3.3 单因素条件对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

(1) 加酶量：取2.0 g坛紫菜粉末，共8份，固液比1∶40(g/mL)，调pH至5.0，分别加入纤维素酶0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08 g，35 ℃酶解1 h后，于20 ℃下超声浸提30 min，超声功率为额定功率的70%(即350 W)，10 000 r/min 离心5 min，取上清液，检测藻红蛋白得率和纯度。

(2) 超声时间：取2.0 g坛紫菜粉末，共5份，固液比1∶40 (g/mL)，调pH至5.0，加入纤维素酶0.02 g，35 ℃酶解1 h 后，分别于20 ℃下超声浸提20，30，40，50，60 min，超声功率为额定功率的70%，10 000 r/min离心5 min，取上清液，检测藻红蛋白得率和纯度。

(3) 超声功率：取2.0 g坛紫菜粉末，共5份，固液比1∶40 (g/mL)，调pH至5.0，加入纤维素酶0.02 g，35 ℃酶解1 h 后，于20 ℃下超声浸提30 min，超声功率分别为额定功率的60%，70%，80%，90%，100%(即300，350，400，450，500 W)，10 000 r/min离心5 min，取上清液，检测藻红蛋白得率和纯度。

(4) pH：取2.0 g坛紫菜粉末，共5份，固液比1∶40 (g/mL)，分别调pH至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，加入纤维素酶0.02 g，35 ℃酶解1 h后，于20 ℃下超声浸提30 min，超声功率为额定功率的70%，10 000 r/min离心5 min，取上清液，检测藻红蛋白得率和纯度。

(5) 料液比：取2.0 g坛紫菜粉末，共5份，固液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)，调pH至5.0，加入纤维素酶0.02 g，35 ℃酶解1 h后，于20 ℃下超声浸提30 min，超声功率为额定功率的70%，10 000 r/min离心5 min，取上清液，检测藻红蛋白得率和纯度。

1.3.4 响应面优化试验 根据单因素试验结果与分析设计响应面试验，进一步优化超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白的工艺条件。

1.4 数据处理

各指标测定均重复3次，采用Excel进行数据统计，数据以3次独立样品测定结果的平均值±标准差表示，并采用ANOVA程序用于方差分析。

2 结果与分析

2.1 加酶量对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

在酶催化反应环境(温度、底物浓度、pH)一定时，酶促反应与加酶量呈正比，但随着催化反应进行，底物浓度减少，催化反应速率降低[12]。由图1可知，当纤维素酶添加量在0.01～0.05 g时，藻红蛋白得率升高、纯度增加；当加酶量为0.05 g时，藻红蛋白的得率和纯度最高，分别为1.469%和0.406；但随着纤维素酶添加量的进一步增加，藻红蛋白得率和纯度降低。综合考虑工业生产成本及藻红蛋白得率和纯度，选择纤维素酶添加量0.04，0.05，0.06 g作进一步研究。

2.2 超声时间对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

由图 2可知，坛紫菜藻红蛋白的得率和纯度均随超声时间的延长呈先升后降的趋势。超声提取20～30 min时，由于超声时间短，坛紫菜细胞壁破坏不完全，藻红蛋白溶出率较低；当超声提取40 min时，藻红蛋白得率和纯度均达到最大，分别为1.298%和0.402；当超声提取50～60 min时，藻红蛋白得率和纯度快速降低，可能与超声时间过长导致藻红蛋白结构被破坏有关。综合考虑生产时间成本及藻红蛋白得率和纯度，选择超声时间30，40，50 min作进一步研究。

图1 加酶量对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

Figure 1 Effect of enzyme amount on the extraction rate and purity of phycoerythrin fromPorphyrahaitanensis

图2 超声时间对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

Figure 2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate and purity of phycoerythrin fromPorphyrahaitanensis

2.3 超声功率对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

超声功率影响超声作用，超声功率越高，空化强度越大，超声效果越好，有效成分分离越快。由图3可知，藻红蛋白得率随着超声功率的不断增加而增大，当达到额定功率的100%时，藻红蛋白得率最高(1.380%)。但藻红蛋白纯度随超声功率的不断增加呈先升高后降低的趋势；超声功率为额定功率的60%～90%时，藻红蛋白纯度快速增加；当超声功率为额定功率的90%时，藻红蛋白纯度达到最大(0.398)；而随着超声功率的继续升高，藻红蛋白纯度降低，可能与超声功率过高导致提取物中其它杂质溶出有关。综合考虑能量消耗成本及藻红蛋白得率和纯度，选择超声功率为额定功率的80%，90%，100%作进一步研究。

2.4 pH对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

由图4可知，坛紫菜藻红蛋白的得率和纯度均随pH值的增加先升高后降低，且在pH为5.0时，藻红蛋白的得率和纯度达到最大，分别为1.001%和0.367。这是由于pH影响纤维素酶的活性，过酸或过碱的溶液均会降低纤维素酶的活性，导致藻红蛋白得率和纯度降低。进一步分析表明，在相同提取条件下，pH值对藻红蛋白得率和纯度的影响显著(P<0.05)低于加酶量、超声时间、超声功率；因此，优化试验时固定酶解反应pH为5.0。

图3 超声功率对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

Figure 3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate and purity of phycoerythrin fromPorphyrahaitanensis

图4 pH对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

Figure 4 Effect of pH on the extraction rate and purity of phycoerythrin fromPorphyrahaitanensis

2.5固液比对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

由图5可知，坛紫菜藻红蛋白的得率和纯度均随液固比的增大呈先升后降的趋势。当固液比为1∶40 (g/mL)时，藻红蛋白的得率最高(1.008%)；当固液比为1∶30 (g/mL)时，藻红蛋白的纯度最大(0.376)。说明溶剂用量低，固液两相间的浓度差小，传质推动力弱，无法充分提取坛紫菜中的藻红蛋白；溶剂用量高，虽可增大固液两相间的浓度差，但也导致提取物中其它杂质的溶出，从而降低藻红蛋白的纯度。进一步分析表明，在相同提取条件下，固液比对藻红蛋白得率和纯度的影响显著(P<0.05)低于加酶量、超声时间、超声功率；且固液比为1∶30 (g/mL)时藻红蛋白的纯度与固液比为1∶40 (g/mL)时差异不显著(P>0.05)；因此，优化试验时固定固液比为1∶40 (g/mL)。

2.6 响应面试验结果

2.6.1 Box-Behnken试验设计及结果 根据单因素试验结果及分析，鉴于pH值及固液比对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响较小，故采用响应面法优化坛紫菜藻红蛋白提取工艺时，考察加酶量、超声时间和超声功率对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响。响应面试验设计因素及水平见表1，试验设计方案及数据处理结果见表2。

2.6.2 模型建立及显著性分析 按照Box-Behnken试验设计的统计学要求，对试验数据进行二次多元回归拟合，获得项目指标对影响因子的关系为：

图5 固液比对坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响

Figure 5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate and purity of phycoerythrin fromPorphyrahaitanensis

Y1=1.81+0.052X1-0.026X2+0.066X3+0.007X1X2-0.03X1X3-0.012X2X3-0.14X12-0.22X22-0.011X32，

(3)

Y2=0.46+0.009X1+0.001X2-0.008X3-0.002X1X2+0.014X1X3+0.005X2X3-0.018X12-0.038X22-0.027X32。

(4)

为检验上述二次多元回归方程的有效性，进一步对超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白得率和纯度的系数和回归模型进行方差分析，结果见表3、4。

由表3可知，回归方程中的一次项X1、X2、X3对Y1的影响极显著(P<0.01)，X1对Y2的影响极显著(P<0.01)，X3对Y2的影响显著(P<0.05)，但X2对Y2的影响不显著(P>0.05)；回归方程中的二次项X12、X22对Y1的影响极显著(P<0.01)，X32对Y1的影响显著(P<0.05)，且X12、X22、X32对Y2的影响极显著(P<0.01)；交互项X1X2对Y1、Y2及X2X3对Y2的影响不显著(P>0.05)，但X1X3对Y1、Y2的影响极显著(P<0.01)，X2X3对Y1的影响显著(P<0.05)。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 Factors and levels ofresponse surface experiments design

由表4可知，回归模型的P<0.01，说明二次回归方程模型极显著；Y1、Y2的相关系数R2分别为0.988 5，0.977 1，表明藻红蛋白的得率和纯度实际值与预测值误差小；调整相关系数RAdj2分别为0.996 5，0.947 6，表明藻红蛋白得率和纯度的模型仅有0.003 5，0.002 4不能用上述二次多元回归方程模拟；且适合度缺损项P>0.05为不显著，进一步说明回归模型与实际情况拟合程度高。

表2 响应面试验设计方案及数据处理结果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白得率和纯度系数的方差分析

模型项目指标系数评估标准误差方差和均方差F值P值常数项X1X2X3X1X2X1X3X2X3X12X22X32Y11.8100.004Y20.4600.003Y10.0520.0030.0220.022269.01<0.0001Y20.0090.0026.661×10-46.661×10-414.420.0067Y1-0.0260.0030.0050.00566.93<0.0001Y20.0010.0021.513×10-51.513×10-50.330.5851Y10.0660.0030.0350.035427.17<0.0001Y2-0.0080.0024.805×10-44.805×10-410.400.0146Y10.0070.0052.102×10-42.102×10-42.580.1524Y2-0.0020.0031.600×10-51.600×10-50.350.5747Y1-0.0300.0050.0030.00342.670.0003Y20.0140.0037.562×10-47.562×10-416.370.0049Y1-0.0120.0055.290×10-45.290×10-46.480.0383Y20.0050.0039.025×10-59.025×10-51.950.2049Y1-0.1400.0040.0880.0881081.80<0.0001Y2-0.0180.0030.0010.00131.020.0008Y1-0.2200.0040.2000.2002414.20<0.0001Y2-0.0380.0030.0060.006134.72<0.0001Y1-0.0110.0044.664×10-44.664×10-45.720.0481Y2-0.0270.0030.0030.00364.96<0.0001

表4 回归模型的方差分析†Table 4 Analysis of variance of regression model

† ***表示差异极显著(P<0.01)；Y1：R2=0.988 5，RAdj2=0.996 5；Y2：R2=0.977 1，RAdj2=0.947 6。

2.6.3 响应面交互作用分析 响应面图可直观地体现各影响因子对项目指标的影响[15]。由图6、7可知，超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白的影响因子对藻红蛋白得率和纯度的影响不同。其中，图6(a)和图7(a)的响应面图曲面坡度平缓，等高线排列稀疏且趋于圆形，表示X1、X2对Y1、Y2的交互影响小；图6(b)和图7(b)的响应面图曲面坡度陡峭，等高线排列紧密切趋于椭圆形，说明X1、X3对Y1、Y2的交互影响大；图6(c)和图7(c)表明，X2和X3对Y1存在交互作用，但X2、X3对Y2交互作用不显著。

图6 提取条件对坛紫菜藻红蛋白得率交互影响的曲面图及等高线图

图7 提取条件对坛紫菜藻红蛋白纯度交互影响的曲面图及等高线图

2.6.4 提取参数优化及模型验证 通过采用Box-Behnken试验设计以及Design-Expert 8.0分析软件对藻红蛋白得率和纯度回归模型进行分析，得出超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白最优组合为：加酶量0.05 g、超声时间39.79 min、超声功率为额定功率的91.07%(额定功率为500 W)；在此操作条件下，藻红蛋白的得率为1.819%，纯度为0.465。考虑实际操作的可行性，最优提取参数调整为：加酶量0.05 g、超声时间40 min、超声功率为额定功率的90%，藻红蛋白理论得率为1.810%，纯度为0.460；在此条件下通过3 次平行实验验证，得出藻红蛋白实际得率和纯度分别为(1.808±0.007)%和0.460±0.001，实际值与理论值相差极小。因此认为，本试验所建立的回归模型可较好预测坛紫菜藻红蛋白的得率和纯度。

3 结论

通过试验优化得出超声波协同酶解提取坛紫菜藻红蛋白的最佳工艺参数为：pH 5.0、固液比1∶40 (g/mL)，加酶量0.05 g，超声时间40 min，超声功率为额定功率的90%；该条件下藻红蛋白的得率和纯度分别为(1.808±0.007)%和0.460±0.001。在超声波协同纤维素酶酶解的双重作用下，可有效缩短坛紫菜藻红蛋白的提取时间，有利于大批量的工业化生产。但在采用超声波破壁的过程中，部分声能可转化为热能从而引起藻红蛋白提取液的温度升高，而且超声波的空穴作用，可能会导致藻红蛋白结构和生物活性发生变化。因此，在后续研究中，将借助傅里叶红外光谱、扫描电子显微镜观察以及化学分析等方法探讨超声波协同酶解对藻红蛋白结构和生物活性的影响。

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OptimizationofphycoerythrinextractionfromPorphyrahaitanensisbyultrasound&hydrolysis

The optimization of phycoerythrin extraction fromPorphyrahaitanensiswere investigated by single experiments and response surface methodology. The single experiments were used to explore the effects on the extraction rate and purity of phycoerythrin by different enzyme amount, ultrasonic time, ultrasonic power, pH and solid-liquid ratio. The best pH and solid-liquid ratio were determined as 5.0 and 1∶40 (g/mL), respectively. Meanwhile, the enzyme amount, ultrasonic time and ultrasonic power were investigated through response surface experiment. The optimal extraction conditions were determined as follows: enzyme amount 0.05 g, ultrasonic time 40 min and ultrasonic power 90% of the rated one. Under these conditions, the extraction rate and purity of phycoerythrin were reached (1.808±0.007)% and 0.460±0.001, respectively.

Porphyrahaitanensis; phycoerythrin; ultrasound; cellulase

农业行业标准制定和修订(编号：181721301092371054)

孔祥佳(1983—)，女，福建中医药大学讲师，博士。

E-mail: nihaojia2005@126.com

2017—07—14

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.033