家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性分析

马强+刘方燕+党晓群+孙厚良+李国利+熊书+潘国庆+周泽扬

摘要：为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性，采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析，并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征，以验证其保守性；进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料，利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现，Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守，Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带，而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带，说明Nbslp2相对保守，并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标；RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性，进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用，为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。

关键词：家蚕微孢子虫；表达特征；定位；功能；保守性；转录活性；共线性；多重序列比对；系统进化

中图分类号：S884.2+1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0150-04

收稿日期：2017-04-06

基金项目：重庆三峡医药高等专科学校苗圃工程项目（编号：2014mpxz1）；重庆市基础与前沿研究计划（编号：cstc2014jcyjA80019）。

作者简介：马 强（1986—），男，云南玉溪人，硕士，讲师，主要从事微生物功能基因组学研究。Tel：（023）58556819；E-mail：cjmaqiang@163.com。

通信作者：周泽扬，教授，博士生导师，主要从事微生物学及家蚕分子生物学研究。Tel：（023）68251088；E-mail：zyzhou@swu.edu.cn。 微孢子虫（microsporidia）能够感染宿主并且通过自由孢子形式进行传播，是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物，至今已发现并报道的微孢子虫种类已经超过1 300种，分别被归入160多个属，能够广泛寄生于几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物，包括人类[1-2]。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是1857年Nageli首次从病蚕体内鉴定出的人类历史上第1种微孢子虫，它能引起家蚕微粒子病，这种病害曾在19世纪给欧洲、美国以及亚洲的蚕业生产造成严重损失，直到现在这种病害也常有发生[3-4]。由于它的危害性巨大，一直以来都很受关注，在许多养蚕国家和地区，家蚕微孢子虫被列为蚕业生产上唯一的法定检疫对象。

微孢子虫作为专性的细胞内寄生生物，其生活史的完成必须严格依赖于宿主提供的营养和能量。家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原，其侵染和致病机理目前仍不清楚。普遍的观点认为，家蚕微孢子虫通过释放蛋白酶，水解寄主细胞内容物，掠夺宿主营养物质，完成其在宿主家蚕细胞内的增殖[5-6]。因此，分泌性蛋白酶被认为是致病性真菌重要的毒力因子。这些蛋白酶不仅参与孢子的入侵过程，还可以与宿主的免疫系统相互作用。类枯草杆菌蛋白酶（subtilisin-like protease，SLP）为丝氨酸蛋白酶家族成员，广泛存在于细菌、真菌和寄生虫等生物中。近年研究表明，类枯草杆菌蛋白酶与病原性细菌、真菌的致病性相关[7-8]，在真菌孢子形成、蛋白质降解及细胞自噬等方面起着非常重要的作用[9-11]。随着家蚕微孢子虫基因组测序的完成，通过序列比对发现在家蚕微孢子虫中也存在类枯草杆菌蛋白酶。因此，笔者推测家蚕微孢子虫可能在入侵过程中会分泌类枯草杆菌蛋白酶，通过降解昆虫体壁帮助其入侵宿主细胞。基于此，本研究在已鉴定报道的3个类枯草杆菌蛋白酶基因（Nbslp1、Nbslp2-1和Nbslp2-2）的基础上[12]，分析了第2个类枯草杆菌蛋白酶基因Nbslp2的保守性及转录情况，为进一步研究该基因在家蚕微孢子虫中的定位和功能探索提供重要的依据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂和仪器

家蚕微孢子虫CQ1分离株由西南大学蚕病研究室分离获得，保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC，保藏号为CVCC102059）。

Trizol、琼脂糖购于Invitrogen公司；乙二胺四乙酸钠（EDTA）购于USB公司；DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、dNTP、Oligo（dT）、Taq酶和DL2000 DNA Marker购于TaKaRa公司；羊抗鼠IgG-HRP、玻璃珠（150～212 μm）购自Sigma公司；PVDF膜购自Roche公司；EasySee Western Marker购自北京全式金生物技术有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）和3-（N-吗啉）丙磺酸购于生工生物工程上海（股份）有限公司；三氯甲烷购于重庆化学试剂有限公司；甲醛购于重庆北碚化学试剂厂。所需要的特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 家蚕微孢子虫Nbslp2的多重序列比对及共线性分析

根据笔者所在实验室构建的家蚕微孢子虫全基因组数据库，结合NCBI公共数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）、蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、肠脑炎微孢子虫（Encephalitozoon intestinalis）以及肠道微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）的基因组数据，利用ClustalX软件对slp2的同源基因序列进行多重序列比对，用Boxshade对比对后的结果进行修正。同时分析slp2在几种微孢子虫数据库中的基因座位信息、基因長度、垂直同源基因的对应关系，利用在线软件http：//microbe.swu.edu.cn/cgi-bin/synteny进行共线性图谱的绘制。此外，分别选择真菌、细菌、顶复亚门、微孢子虫门几个代表物种，对各物种中的slp2的同源序列进行多序列比对，将多序列比对结果使用MEGA 5.0程序构建系统发生树，设置信度为1 000。endprint

1.3 家蚕微孢子虫Nbslp2的保守性分析

利用Western blot分析家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2在家蚕微孢子虫（N. bombycis）、柞蚕微孢子虫（N. antheraeae）以及纳卡变形微孢子虫（Vairimorpha necatrix）中的表达特征，以验证其保守性，分别取1×109纯化的上述3种微孢子虫孢子沉淀，加400 μL PBS（pH值7.3）重新悬浮，同时分别称取0.4 g玻璃珠加到3管孢子悬液中，加入PMSF，4 ℃涡旋振荡6 h，然后4 ℃、12 000 r/min离心 10 min，收集上清液，得到3种微孢子虫的孢子总蛋白，之后将提取获得的3种孢子总蛋白定量后进行SDS-PAGE，转PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液（现用现配）4 ℃封闭过夜，之后用TBST溶液洗涤封闭液，重复3次，然后加入制备的抗血清anti-NbSLP2（1 ∶6 000）作为一抗，室温孵育 1 h。辣根酶标记山羊抗鼠lgG（1 ∶8 000）为二抗，37 ℃孵育1 h，ECL发光系统检测，暗室内X胶片显影Western blot检测结果。

1.4 家蚕微孢子虫Nbslp2的转录活性分析

利用RT-PCR分析家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的转录特征。取感染家蚕微孢子虫1～10 d的家蚕中肠组织，加入1.0 mL Trizol，液氮研磨，转入1.5 mL EP管，混匀，静置5 min后加入200 μL三氯甲烷，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。取上层水相移入EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10 min，低温离心，加入1 mL预冷的0.1% DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥RNA沉淀15 min，加入20 μL RNase-Free ddH2O将沉淀溶解。琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断RNA的完整性。将提取的家蚕微孢子虫总RNA反转录为cDNA，并以此cDNA为模版，设计家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的引物，slp2-F：5′-GGATCCATGCTGTTTGTTCTTCTTAT-3′和slp2-R：5′-GTCGACTCAATTTACATGTATTGTAG-3′；以家蚕微孢子虫β-tubulin基因作为内参，Tub-F：5′-TGGACGCCATTAG ACAAG-3′和Tub-R：3′-TCTAAAGACAGCAGCCAC-3′进行PCR扩增，扩增程序为94 ℃预变5 min；94 ℃变性30 s、55 ℃ 退火1 min、72 ℃延伸1 min，共25个循环。

2 结果与分析

2.1 家蚕微孢子虫Nbslp2的共线性分析

Nbslp2在家蚕微孢子虫基因组中有2个拷贝，该基因家族在微孢子虫染色体/scaffold上的位置相对保守（图1），且Nbslp2在Nosema属的微孢子虫基因组中的排布比在Encephalitozoon属的位置更具线性关系。

2.2 家蚕微孢子虫Nbslp2的多重序列比对分析

采用ClustalX软件对Nbslp2与其他微孢子虫，细菌、真菌、寄生虫等其他物种的同源基因进行多重序列比对，结果显示，Nbslp2序列中都具备行使类枯草杆菌蛋白酶催化功能的保守氨基酸位点（图2），分别是Asp282、His304、Ser460。不同微孢子虫种间slp2的氨基酸序列相似度较高。

2.3 家蚕微孢子虫Nbslp2的系统进化分析

为了进一步分析家蚕微孢子虫slp2基因与其他物种中同源基因的进化关系，以它们的蛋白质序列构建了邻接法进化树。系統进化树的结果（图3）表明，家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2与蜜蜂微孢子虫（N. ceranae）、兔脑炎微孢子虫微孢子虫（E. cuniculi）、肠脑炎微孢子虫（E. intestinalis）聚为一支，且亲缘关系较近，暗示slp2在微孢子虫基因组中的进化较为保守。

2.4 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的保守性分析

通过Western blotting从蛋白水平分析Nbslp2在家蚕微孢子虫（N. bombycis）、柞蚕微孢子虫（N. antheraeae）以及纳卡变形微孢子虫（Vairimorpha necatrix）中的表达特征，结果如图4所示。Nbslp2在家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫中有表达，且在柞蚕微孢子虫中检测到2条大小位置不一的条带，而在纳卡变形微孢子虫中未检测到杂交信号，因此，可将Nbslp2作为区分上述3种微孢子虫的靶标。

2.5 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的转录活性分析

利用RT-PCR研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因在感染家蚕后的转录情况。结果如图5所示，Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性，并且该转录活性会随着感染时间的延长有逐渐减弱的趋势，说明Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用。

3 结论与讨论

自1954年第1个枯草杆菌分泌的蛋白酶被鉴定以来[13]，国内外学者对subtilisin进行了深入而广泛的研究，截止到目前为止NCBI中已收录了17 868条蛋白质序列，11 135 条基因序列，其中389个subtilisin的三维结构已被解析。本研究主要是在已鉴定的3个家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶基因Nbslp1、Nbslp2-1和Nbslp2-2基础上，结合家蚕微孢子虫基因组数据库和生物信息学方法对其中的Nbslp2-1（Nbslp2）基因序列进行生物信息学分析。通过共线性、多重序列比对以及系统进化分析发现，Nbslp2在Nosema属微孢子虫基因组中的位置较为保守。通过Western blotting对Nbslp2的保守性进一步分析发现，在家蚕微孢子虫（N. bombycis）和柞蚕微孢子虫（N. antheraeae）有该蛋白的存在，而在纳卡变形微孢子虫（V. necatrix）中没有，因此，可以利用Nbslp2作为区分家蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的分子靶标。同时，免疫印迹的结果还显示，Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫中出现2个杂交信号，且大小位置不一，以此可以作为区分家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的靶标。因此，可将Nbslp2作为蚕业生产上潜在的检测靶标。endprint

研究人员对兔脑炎微孢子虫中2个类枯草杆菌蛋白酶（slp1和slp2）转录活性分析后发现，由芽体分化为母孢子的过程中它们的转录水平上调3倍[14]；同样对家蚕微孢子虫在感染家蚕不同时期Nbslp1的转录活性进行检测，发现Nbslp1在家蚕微孢子虫感染家蚕1 d后就有转录，暗示其可能在侵染初期发挥作用[12]；据此推测家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2在微孢子虫的增殖发育过程中可能也发挥重要作用。随后的转录活性检测发现，Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录，并且该转录活性会随着感染时间的延长有逐渐减弱的趋势，这一结果暗示着Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥重要作用。鉴于上述的预测和分析结果，后续将开展对Nbslp2基因的研究。

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