梅花鹿鹿茸组织PDGFA基因cDNA克隆及序列分析1)

梁运涛 卢斌山 张强 高悦禹 夏彦玲

(东北林业大学，哈尔滨,150040)

梅花鹿鹿茸组织PDGFA基因cDNA克隆及序列分析1)

梁运涛 卢斌山 张强 高悦禹 夏彦玲

(东北林业大学，哈尔滨,150040)

为了探讨PDGFA基因的结构和功能，采用RT-PCR方法获得梅花鹿PDGFA基因，并运用生物信息学软件对其序列进行了分析。结果表明：梅花鹿PDGFA基因开放阅读框大小为591 bp，共编码196个氨基酸，蛋白的分子质量约为22 ku，理论等电点(pI)为8.53，是亲水性蛋白，具有信号肽。二级结构分析显示，含有47.45%无规则卷曲、39.29%α-螺旋、13.27%扩展链。进化分析显示，PDGFA蛋白与白尾鹿(Odocoileusvirginianustexanus)、家牛(Bostaurus)、山羊(Caprahircus)、野猪(Susscrofa)、白犀牛(Ceratotheriumsimum)、小鼠(Musmusculus)、密西西比鳄(Alligatormississippiensis)、原鸡(Gallusgallus)、绒啄木鸟(Picoidespubescens)的蛋白质序列相似度分别为98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。

梅花鹿；PDGFA基因；克隆；序列分析；进化分析

鹿茸为雄鹿(驯鹿除外)未骨化而带有茸毛的幼角，含有多种生理活性物质，具有提高身体机能、补肾壮阳、生精益血和补髓健骨的作用。鹿茸在哺乳动物角中的独特之处在于其会周期性的脱落和再生，其细胞增殖速度远高于肿瘤细胞增殖速度，所以鹿茸的生长发育机制一直都是科学家研究和关注的热点。

血小板衍生生长因子A(PDGFA)是血小板衍生生长因子大家族的一员，由多种细胞产生[1]，其通过结合和活化高度特异的细胞膜表面受体PDGFRα来激活PDGF/PDGFR通路，从而发挥相应的生物学效应[2]。PDGFA主要表达于表皮细胞、肌细胞和神经元前体，对胚胎发育、细胞分化和组织损伤反应过程有重要的作用，并在一些生理过程中刺激细胞的增殖和迁移[3]。本研究以梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸组织为研究对象，克隆了PDGFA基因的CDS全序列，利用生物信息学方法分析基因序列，为进一步研究该基因在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取人工饲养的1头东北梅花鹿，切取鹿茸顶端约5 cm，将其表面消毒并剖开，取其顶端组织样品，保存于液氮中。

1.2 RNA的提取与反转录

采用Trizol法提取样本组织的总RNA[4]，然后用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的总RNA质量和浓度。取1 μL总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明操作合成梅花鹿鹿茸的cDNA。

1.3 PDGFA基因的cDNA克隆

参照GenBank上家牛的PDGFA基因序列设计1对同源引物(F：5′-GATGAGGACCTGGGCTTG-3′，R：5′-TCAGGAATGTAACACGCCA-3′)。PCR反应体系(25 μL)，rTaqDNA聚合酶0.25 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 16.75 μL。扩增条件为，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，57 ℃复性30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

按照pMD18-T载体说明书将纯化的目的片段与pMD18-T载体连接，然后转化到DH5α感受态细胞中，在37 ℃震荡培养箱中摇床1 h后接种到LB固体培养基中，37 ℃过夜恒温培养；利用蓝白斑筛选，选取单个、饱满的白色菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃摇床培养8 h；对菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆检测的样品送到华大公司进行测序。

1.4 生物信息学分析

将测序结果在NCBI中进行BLAST分析比对，运用ORF Finder程序分析基因的CDS区[5]。运用ExPASy在线服务器上的ProtParam程序、ProtScale程序、TMpred程序进行蛋白质的理化性质、亲疏水性和蛋白跨膜区分析。运用SignalP 3.0程序进行信号肽预测分析。运用PSORT在线服务器中的PSORT Ⅱ程序对蛋白质进行亚细胞定位预测分析[6]。运用Predict protein程序进行蛋白质的二级结构预测与分析[7]。运用ExPASy服务器上的SWISS-MODLE程序进行蛋白质的三级结构同源建模[8]，并应用SWISS-PdbViewer(Deep View)软件来评估此次建模的质量[9]。最后，运用Clustal程序进行物种间氨基酸多序列的完全对比，通过MEGA6.0软件构建NJ-系统进化树来分析梅花鹿PDGFA基因与其他物种的PDGFA基因进化的远近关系[10]。

2 结果与分析

2.1 PDGFA基因的cDNA克隆

从梅花鹿顶端组织中提取总RNA，电泳后清晰可见3条带，OD260/OD280比值为1.98。RT-PCR扩增目的基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在500～750 bp出现单一条带，与预期片段大小一致(图1)。扩增产物经PCR鉴定后，送生物公司测序。测序结果表明，获得的PDGFA基因cDNA序列为657 bp。

M.DL2000Maker；1.PDGFA基因编码区PCR扩增产物。

2.2 序列分析

将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，确认是梅花鹿的PDGFA基因。运用NCBI的ORF Finder程序分析梅花鹿PDGFA基因，获得长591 bp的编码区(图2)，其CDS区共编码196个氨基酸残基。PDGFA基因A、T、G、C碱基组成分别为22.40%、14.30%、33.84%、29.84%。(G+C)%为63.68%高于(A+T)，说明PDGFA编码区的DNA双链比较稳定。

2.3 PDGFA基因的分析进化

应用NCBI数据库中Blastp功能对比后，从GenBank下载9个物种PDGFA蛋白的氨基酸序列，梅花鹿PDGFA蛋白氨基酸序列与这些物种相似度为78%～98%，其中与白尾鹿(Odocoileusvirginianustexanus)相似度最高，梅花鹿PDGFA蛋白序列与白尾鹿、家牛(Bostaurus)、山羊(Caprahircus)、野猪(Susscrofa)、白犀牛(Ceratotheriumsimum)、小鼠(Musmusculus)、密西西比鳄(Alligatormississippiensis)、原鸡(Gallusgallus)、绒啄木鸟(Picoidespubescens)的同源性分别为98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。结果分析显示，梅花鹿PDGFA基因具有较高的保守性，生物学功能在进化中比较稳定。

运用Blastp程序和Clustal X软件对PDGFA蛋白氨基酸序列进行比对，利用MEGA 6.0软件中Neighbor-Joining算法构建系统进化树。结果显示，从基因座位上看，梅花鹿与白尾鹿、家牛、山羊、野猪亲缘关系较近(图3)，与物种传统分类学情况类似，符合进化关系[11]。

图3 PDGFA系统进化树

2.4 蛋白质特性

2.4.1 蛋白质一级序列

ProtParam程序分析结果显示，梅花鹿PDGFA蛋白由196个氨基酸组成；相对分子质量为22 072.41；理论等电点(pI)为8.53；氨基酸组成中谷氨酸氨酸(Glu)占总体的11.7%，其次为精氨酸(Arg)和丙氨酸(Ala),均为9.7%；分子式为C957H1565N293O284S11；总原子数为3 110，带负电荷的残基数(Asp+Glu)为27，带正电荷的残基数(Arg+Lys)为31；不稳定系数为63.06，是不稳定蛋白；脂肪系数为85.61；总平均亲水性为-0.458，是亲水性蛋白；消光系数为16 095,在哺乳动物红细胞的半衰期为30 h。

2.4.2 亲疏水性

运用ExPASy服务器上的ProtScale程序中Kyte and Doolitlle算法(大于0.5的区域为疏水区，小于-0.5的区域为亲水区，在0.5和-0.5之间的区域为两性区域)对PDGFA蛋白亲疏水性进行分析，结果显示，最小值达到-2.856，最大值为2.356，PDGFA蛋白亲水性较强(图4)。

图4 PDGFA蛋白的亲疏水性预测

2.4.3 信号肽预测

利用在线分析工具SignalP 3.0中的神经网络法(NN)对PDGFA蛋白进行信号肽预测(图5)。结果表明，PDGFA蛋白具有信号肽，位点为20～21:ALA～EE，是分泌性蛋白。

2.4.4 蛋白跨膜区预测

运用ExPASy在线服务器上的TMpred程序对PDGFA蛋白进行跨膜区预测分析(图6)。结果显示，在氨基酸1～19位点从内到外螺旋的得分为1 375，从外到内螺旋得分为1 253，推测PDGFA是跨膜蛋白，与信号肽位点预测结果一致。

图5 PDGFA蛋白信号肽预测

图6 PDGFA蛋白的跨膜区预测

2.4.5 亚细胞定位预测

利用PSORT在线服务器中的PSORT Ⅱ程序对PDGFA蛋白进行亚细胞定位预测分析，结果显示，PDGFA蛋白有55.6%的可能性分泌到细胞外，有22.2%的可能性存在于线粒体中，有11.1%的可能性存在于细胞核内，有11.1%的可能性存在于分泌系统囊泡中。

2.5 蛋白质二级结构预测

运用ExPASy在线服务器上的GOR4程序对PDGFA蛋白的二级结构进行预测分析(图7)。结果表明，PDGFA基因以无规则卷曲为主，其次为α-螺旋和扩展链，分别占47.45%、39.29%、13.27%。

2.6 蛋白质三级结构预测

运用ExPASy在线服务器上的SWISS-MODLE程序对PDGFA蛋白质的三级结构进行同源建模(图8A)，并运用软件SWISS-PdbViewer(Deep View)进行检测来评估此次建模的质量(图8B)。分析显示，PDGFA蛋白残基集中于中心区域内，说明此空间结构稳定，SWISS-MODLE程序对PDGFA蛋白质的三级结构同源建模结果可靠。

图8 PDGFA蛋白三级结构预测(A)及建模检测(B)

3 讨论

研究证实PDGFA与多种肿瘤及血管性疾病如动脉粥样硬化、肺部高压、肾脏疾病、心瓣手术再狭窄，还有一些纤维性疾病如肺纤维化、肝硬化、硬皮病、肾小球硬化症、心脏纤维化等疾病的发生密切相关[12]。而且它是调控肿瘤血管生成的重要因子，其通过募集周细胞来刺激肿瘤血管生成，并保证肿瘤细胞的生长和生存[13]。另外，PDGFA还能促进结缔组织细胞增殖，对造血干细胞、巨核细胞、血小板，以及骨髓微环境的血小板生成素合成有重要的调节作用[2]。在PDGF信号发挥作用的肿瘤性疾病中，可以使用一些抑制剂进行治疗。有研究报道，在多形性恶性胶质瘤中，PDGFA结合右旋糖酐后再与PDGFRα结合，已经成为潜在的治疗新靶点[14]。

本研究成功克隆了梅花鹿PDGFA基因cDNA序列，该基因开放阅读框包含591 bp，编码196个氨基酸。生物信息学分析发现,PDGFA蛋白具有信号肽，属于分泌性蛋白。二级结构预测表明,PDGFA蛋白以无规则卷曲为主，其次为α-螺旋，扩展链最少。系统进化分析表明,PDGFA蛋白氨基酸序列与白尾鹿的相似度达到了98%，与家牛、山羊和野猪的亲缘关系也比较近，符合传统的分类学进化关系，也提示PDGFA基因序列比较保守，在不同物种中行使的功能可能相似。鹿茸角生长速度惊人，鹿茸顶端组织细胞生长速度比癌细胞生长速度还要快，因此克隆梅花鹿PDGFA基因对于探索鹿茸生长的奥秘和丰富鹿茸研究的分子生物学信息有着重要意义。

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CloningandSequenceAnalysisofthePDGFAGenecDNAinSikaDeerAntlerTissue//

Liang Yuntao, Lu Binshan, Zhang Qiang, Gao Yueyu, Xia Yanling

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

Sika Deer;PDGFAgene; Cloning; Sequence analysis; Evolutionary analysis

1)中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014CA01)；中国博士后科学基金项目(20110491124)。

梁运涛，男，1990年2月生，东北林业大学野生动物资源学院，硕士研究生。E-mail：liangyt1991@163.com。

夏彦玲，东北林业大学野生动物资源学院，副教授。E-mail：xiayanling1974@163.com。

2017年6月1日。

责任编辑：程 红。

S825.2

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(11)：89-93.

To explore the structure and function ofPDGFAgene, we used the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) to clone the cDNA sequence of thePDGFAgene from sika deer (Cervusnipponhortulorum). We further analyzed the sequence using different bioinformatics software. The open reading fragment size of thePDGFAgene was 591 bp, encoding 196 amino acids. The relative molecular weight ofPDGFAprotein was about 22 kD and the theoretical isoelectric point (pI) was 8.53.PDGFAprotein was hydrophilic and had a signal peptide. From secondary structure analysis,PDGFAprotein included 47.45% random curl, 39.29% alpha-helix and 13.27% extension chain. By evolutionary analysis,PDGFAprotein sequences shared the homologies withOdocoileusvirginianustexanus,Bostaurus,Caprahircus,Susscrofa,Ceratotheriumsimum,Musmusculus,Alligatormississippiensis,Gallusgallus,Picoidespubescenswere 98%, 97%, 96%, 94%, 93%, 89%, 81%, 79% and 78%, respectively.