实时荧光核酸恒温扩增检测技术在疑似肺结核早期诊断中的临床意义

江万航 卫安娜 庞慧敏 谭守勇

·论著

实时荧光核酸恒温扩增检测技术在疑似肺结核
早期诊断中的临床意义

江万航 卫安娜 庞慧敏 谭守勇

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing，SAT)用于疑似肺结核早期诊断的临床意义。方法分析2015年7—12月广州市胸科医院收治的呼吸道疾病患者338例，其中疑似肺结核患者242例(疑似肺结核组)，临床已排除肺结核的肺部其他疾病患者96例(对照组)。所有患者同时进行了痰SAT检测、抗酸杆菌涂片、分枝杆菌培养和菌种鉴定等检查；统计疑似肺结核患者菌种鉴定结果，对SAT检测与结核分枝杆菌(MTB)培养及菌种鉴定结果的符合率、SAT检测诊断疑似肺结核的敏感度和特异度进行分析。结果疑似肺结核组242例患者中痰培养阳性233例，菌种鉴定为MTB感染者222例，非结核分枝杆菌(NTM)感染者11例；痰培养结果为阴性的患者9例。对照组患者痰培养结果均为阴性。菌种鉴定为MTB感染者SAT检测阳性192例，SAT检测与菌种鉴定符合率为86.5%(192/222)；菌种鉴定为NTM感染者SAT检测阳性0例(0/11)，与菌种鉴定符合率为100.0%(11/11)；对照组SAT检测阳性者2例(2.1%，2/96)，与分枝杆菌培养符合率为97.9%(94/96)。SAT在疑似肺结核患者诊断中的敏感度为86.5%(192/222)，特异度为97.9%(94/96)。结论在疑似肺结核患者中开展SAT检测对肺结核早期诊断具有重要临床意义。

结核，肺； 核酸扩增技术； 早期诊断； 分枝杆菌感染, 非典型性； 呼吸道疾病

早期、及时、准确诊断是肺结核诊治的关键，随着分子生物学技术的发展，实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing，SAT)进入了结核病诊断领域，其具有检测时间短，敏感度、特异度高的特点，逐渐引起临床重视。有文献报道，SAT检测不仅可快速检测痰标本中的结核分枝杆菌(MTB)，而且可判断待检痰液中MTB是否为活菌[1]，2～3 h即可获得检测结果[2]，在耗时和检测成本上均低于Xpert MTB/RIF法[3]，且试验要求较荧光PCR扩增法低[4]，可快速、准确地对肺结核做出早期诊断[5]。

本研究回顾性分析2015年7—12月广州市胸科医院收治的痰抗酸杆菌涂片连续3次阳性的疑似肺结核患者242例，同时纳入临床已排除肺结核的肺部其他疾病患者96例，进行了痰SAT检测、分枝杆菌培养和菌种鉴定等检查，探讨在疑似肺结核患者中开展SAT检测对肺结核早期诊断的临床意义。

对象和方法

一、研究对象

1.疑似肺结核组：对2015年7—12月在广州市胸科医院结核科住院的所有呼吸系统疾病患者进行筛查，符合下列条件的患者进入本研究：痰抗酸杆菌涂片连续3次阳性，同时完成痰SAT检测、分枝杆菌培养和菌种鉴定等检查；剔除检查资料不完整的患者。入组疑似肺结核患者242例，其中男158例，女84例；年龄18～70岁，平均(47.5±11.6)岁。肺结核的临床诊断依据文献[6]。

2.对照组：收集同期广州市胸科医院收治的临床已排除肺结核的肺部其他疾病患者96例，其中男55例，女41例，年龄28～68岁，平均(43.3±10.1)岁；包括慢性阻塞性肺疾病58例(60.4%)，肺炎17例(17.7%)，肺癌5例(5.2%)，支气管扩张9例(9.4%)，肺曲霉菌病5例(5.2%)，尘肺2例(2.1%)。上述患者的诊断均依据相关诊断标准[7-8]。

本研究所有患者HIV检查均为阴性。本研究通过广州市胸科医院伦理委员会的审批。

二、研究方法

标本涂片根据《结核病诊断实验室检验规程》[9]处理，经金胺“O”-罗丹明荧光染色检测分枝杆菌，应用BACTEC MGIT 960 和专用培养基进行分枝杆菌分离培养，采用常规生化鉴定法和基因芯片法进行菌种鉴定。SAT检测试剂盒由上海仁度生物科技有限公司提供。

痰标本留取：入院后第二天，患者于清晨漱口后，同时留取1次痰SAT检测标本、3次痰抗酸杆菌涂片标本、1次痰分枝杆菌培养标本，对于培养阳性标本进一步行菌种鉴定，阳性报告结果为MTB生长或非结核分枝杆菌(NTM)生长。痰涂片及培养操作按《现代结核病诊断技术》[10]进行。

菌种鉴定的方法和试剂：对培养阳性的标本进行涂片镜检，做MPB64分泌蛋白抗原检测，检测阳性标本加做对硝基苯甲酸(PNB)生长试验，确认是否为MTB。MPB64分泌蛋白抗原检测阴性培养物进行晶芯@基因芯片分枝杆菌菌种鉴定[11]。MPB64分泌蛋白抗原检测试剂盒由杭州创新生物检控技术有限公司提供，晶芯@基因芯片分枝杆菌菌种鉴定试剂盒由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。

三、统计学分析

采用Excel 2007表收集试验数据，使用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。

结 果

一、分枝杆菌培养及菌种鉴定结果

242例疑似肺结核患者，痰培养阳性233例；其中菌种鉴定结果为MTB感染者222例，菌种鉴定结果为NTM感染者11例。痰培养结果为阴性的患者9例，结合临床资料，此9例患者最终确诊为涂阳培阴肺结核患者。对照组患者培养结果均为阴性。

二、SAT检测的符合率

疑似肺结核组以菌种鉴定结果为金标准，培养阳性菌种鉴定结果为MTB感染的222例患者中SAT检测阳性者192例，SAT检测结果与菌种鉴定结果的符合率为86.5%(192/222)；培养阳性菌种鉴定结果为NTM感染的11例患者中SAT检测阳性者0例(0/11)，与菌种鉴定结果的符合率为100.0%(11/11)；对照组SAT检测阳性者2例(2.1%，2/96)，均为肺炎患者，与MTB培养的符合率为97.9%(94/96)。

表1 SAT检测结果在不同组别患者中与培养及菌种鉴定结果的比较

注“培养”指痰分枝杆菌培养

三、SAT在疑似肺结核患者诊断中的意义

SAT对疑似肺结核患者诊断的敏感度为86.5%(192/222)，特异度为97.9%(94/96)(表1)。

讨 论

一、SAT检测对疑似肺结核的诊断效率评估

从本研究结果可以看出，以菌种鉴定结果作为金标准，非结核病患者为阴性标准，SAT检测在疑似肺结核诊断中的敏感度为86.5%，特异度为97.9%。从检测时间上看，SAT检测只需2～3 h就能得到结果，速度明显快于培养法[2]，而检测结果与培养法一致率达86.5%，说明SAT检测能够在较短的时间内提供准确率为86.5%的检测结果。本研究9例培养阴性的临床诊断肺结核患者的标本有2例 SAT检测为阳性，提示SAT检测有助于早期快速发现传染源、及时诊治肺结核患者，减少结核病的传播。

将本研究与蔡杏珊等[11]和黄芳等[12]国内同类研究比较，结果相仿；但崔振玲等[13]研究报道的对于痰涂片阳性的标本，SAT检测对肺结核的诊断敏感度可达97.6%。本研究222例培养阳性、菌种鉴定为MTB的患者中有30例SAT检测结果为阴性，SAT检测与菌种鉴定的符合率为86.5%，而非100.0%，说明可能产生了假阴性结果，也可能由于本研究的痰SAT和涂片培养检测不是同一份痰标本，标本的异质性可能导致不同方法的检出结果出现差异。每例患者多份标本进行SAT检测可能会提高阳性检出率。

崔振玲等[13]研究报道，SAT检测对临床确诊的肺结核患者痰标本检出率为54%，高于罗氏培养法(42%)，未发现假阳性现象；本研究对照组出现2例假阳性，均为肺炎患者。虽然RNA在环境中极易降解，不容易发生实验污染，出现假阳性的概率较低，但本研究中SAT-TB检查仍有2例假阳性，经患者追踪，此2例肺炎患者经抗炎治疗后病灶完全吸收，排除肺结核。提示在实验室操作环节仍有出现标本污染的可能，应严格规范各项操作，避免人为因素降低其检验效能。

将SAT技术与目前其他分子生物学诊断方法，如Xpert MTB/RIF进行比较，张青和闫丽萍[14]Meta分析显示，用Xpert MTB/RIF诊断肺结核的敏感度为89%，特异度为98%。本研究显示SAT检测效能与Xpert MTB/RIF相比，有较高的诊断肺结核的敏感度和特异度，同时检查成本较Xpert MTB/RIF更低。

二、SAT检测在NTM肺病诊断中的应用

SAT的检测周期短，除了和培养法一样能够检测鉴别活菌外，还能区分MTB与NTM感染。近年来，随着AIDS的流行，医原性感染机会增多，各种免疫抑制剂的使用，人口老龄化等问题，NTM肺病较以前明显增加，已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[15]。单凭涂片法和培养法难以区分NTM菌株。在无菌种鉴定结果的情况下，NTM肺病可长期被误诊为结核病[16]。本研究入组的242例疑似肺结核患者，痰抗酸杆菌涂片连续3次阳性并同时进行了痰SAT检测、MTB培养和菌种鉴定等检查。菌种鉴定结果显示，MTB感染者222例，NTM感染者11例，NTM菌株在疑似肺结核患者中的检出率为4.5%(11/242)。刘志辉等[17]报道，1994—2003年10年间广州市结核病肺部肿瘤防治所门诊患者的NTM分离率在3.51%～10.06%之间，平均分离率为6.28%。罗春明等[18]报道广州地区2003—2012年10年间的NTM分离率高达20.00%，年分离率从2003年的12.87%上升至2012年的24.22%。

临床确诊NTM肺病的金标准是分枝杆菌培养和菌种鉴定，耗时长且需要使用不同类型的培养基和培养温度使细菌获得最优生长[19]，不能满足临床早期快速诊断的需要，有一定的局限性。

建议对于痰抗酸杆菌涂片阳性患者，有胸部影像学检查结果支持，考虑诊断为肺结核前，可行SAT检测协助诊断，并行分枝杆菌培养及菌种鉴定。SAT检测阳性，支持肺结核的诊断，再开始进行抗结核治疗；SAT检测阴性，需排除NTM肺病，等待分枝杆菌培养及菌种鉴定结果。采用此方法，可降低耗时和检测成本，对于早期避免误诊和漏诊具有重要意义。

三、小结

综上所述，SAT检测在2～3 h内可以准确获得检测结果，在临床简单易行，在疑似肺结核患者中开展SAT检测，对肺结核早期诊断及减少漏诊、误诊具有重要临床意义。

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[4] 白广红，朱蕾，高漫．7种实验方法诊断结核病的临床应用价值．临床荟萃，2014，29(6)：608-611，720．

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[13] 崔振玲，沙巍，黄晓辰，等．RNA恒温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的研究．中华结核和呼吸杂志，2011，34(12)：894-897．

[14] 张青，闫丽萍．三种核酸扩增方法用于诊断肺结核的Meta分析．中国防痨杂志，2017，39(1)：57-70．

[15] 中华医学会结核病学分会，《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会．非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识．中华结核和呼吸杂志，2012，35(8)：572-580．

[16] 肖和平．关注非结核分枝杆菌感染的危害性．中华结核和呼吸杂志，2012，35(8)：563．

[17] 刘志辉，罗春明，蔡杏姗.广州市旧城区1994—2003年非结核分枝杆菌流行状况分析.中华流行病学杂志，2005，26(6)：424-427.

[18] 罗春明，邹桂敏，刘国标，等．广州市2003—2012年非结核分枝杆菌菌种鉴定结果分析.结核病与肺部健康杂志，2014，3(1)：15-20.

[19] 中华医学会结核病学分会，非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识编写组．非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识．中华结核和呼吸杂志，2016，39(6)：438-443.

2017-05-10)

(本文编辑：郭萌)

Clinicalsignificanceofusingthesimultaneousamplificationandtestingmethod(SAT)intheearlydiagnosisofsuspectedpulmonarytuberculosis

JIANGWan-hang,WEIAn-na,PANGHui-min,TANShou-yong.

GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

TANShou-yong,Email: 13802930679@163.com

ObjectiveTo investigate the clinical significance of using the simultaneous amplification and testing method (SAT) in the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.MethodsThree hundred and thirty-eight cases with respiratory disease (including 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis and 96 cases with non-tubercular and other lung diseases) admitted in Guangzhou Chest Hospital from July to December 2015 were recruited in the study. Sputum samples were submitted for testing for SAT, smear, culture and strain identification. The number of cases of infection withMycobacteriumtuberculosis, and non-tuberculosis mycobacteria were determined. The coincidence rate of SAT and MTB culture, SAT and strain identification were calculated, and the sensitivity and specificity of SAT in the detection of suspected pulmonary tuberculosis was determined.ResultsOf the 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis, 233 cases were sputum culture positive, 222 cases were infected withMycobacteriumtuberculosis, and 11 cases with non-tubercular mycobacteria, 96 cases with non-tubercular and other lung diseases were sputum culture negative. In the MTB group, 192 cases were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 86.5% (192/222). In the NTM group, no case (0/11) were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 100.0% (11/11). Of the 96 cases with non-tubercular and other lung diseases, 2 cases were SAT positive (2.1%, 2/96), and the coincidence rate of SAT with MTB culture and strain identification was 97.9% (94/96). The sensitivity of SAT in the diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis was 86.5% (192/222), and the specificity was 97.9% (94/96).ConclusionThe use of the SAT assay has important clinical significance for the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Nucleic acid amplification techniques; Early diagnosis; Mycobacterium infections, atypical; Respiratory tract diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.12.011

广州市科技计划课题(155700012)

510095 广州市胸科医院

谭守勇，Email：tanshouyong@163.com