创伤后应激障碍样大鼠海马区p38MAPK的改变

庞雨婷，邢文龙，张桂青*

（石河子大学医学院第一附属医院康复心理科，新疆 石河子832000）

创伤后应激障碍样大鼠海马区p38MAPK的改变

庞雨婷，邢文龙，张桂青*

（石河子大学医学院第一附属医院康复心理科，新疆 石河子832000）

为探讨精神创伤后应激障碍样大鼠海马区p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的改变及其意义。采用将Wistar大鼠随机分为4组的方法：空白对照组、PTSD 1 d组、PTSD 4 d组、PTSD 7 d组，每组各8只。PTSD组建立SPS模型，采用旷场实验、Morris水迷宫等方法检验各组大鼠造模前后的行为学指标变化并评估造模效果，采用逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）及蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定各组大鼠海马组织中p38MAPK的水平变化。结果显示：应激后大鼠海马区p38MAPK水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。由此可知，创伤后应激障碍大鼠海马区p38MAPK升高，可能与学习及记忆功能受损有关。

应激；丝裂原活化蛋白激酶；免疫印迹法；海马

创伤后应激障碍 (Post-traumatic Stress Disorder，PTSD)是经历重大威胁性或灾难性应激事件后所产生的严重心理障碍[1]。在所有应激相关障碍中PTSD是临床症状最严重、预后最差、对脑功能损害最大的一类应激障碍[2]。创伤后应激障碍的主要危害在于其对学习及记忆功能的严重损害，这与其海马功能受损密切相关。有许多研究表明海马炎症细胞因子表达增加可导致认知功能损害，其损伤的机制与细胞内信号传导通路具有密切联系。丝裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK)是重要的信号转导通路，在细胞生长、发育、分化和凋亡等病理生理过程有着重要作用[3]。

p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，可在生理性应激、脂多糖、渗透性应激和紫外线照射等多种情况下被激活[4]。有研究证实，血管性痴呆(Vascular dementia，VD)小鼠认知功能、记忆功能减退与p38MAPK表达增加有关[5]。王毅鑫等[6]对不同创伤程度患者白细胞p38MAPK基因表达的研究发现，创伤可使其p38MAPK信号通路激活，且创伤的严重程度与p38MAPK的活化程度正相关，证实了p38MAPK信号通路在创伤后应激的分子学机制中发挥重要作用，但目前对创伤后应激大鼠海马区p38MAPK表达的研究较少。本研究旨在探讨创伤后应激创伤大鼠海马p38MAPK表达的变化，以进一步研究创伤后应激障碍发生学习及记忆功能障碍的分子学机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选用6周健康清洁级雄性Wistar大鼠32只，质量(180±20)g，由新疆医科大学实验动物中心提供。实验前严格按12 h/12 h光控时间，温度与湿度分别保持在 (21±2)℃和40%-50%，每日抚摸大鼠5 min，适应环境1周。将实验大鼠随机分为4组：空白对照组、PTSD1d组，PTSD 4d组、PTSD7d组，每组各8只。在随机分组中每组中都可随机分配到一只体质量(或其他因素)极为近似的动物，各组动物的平均体质量基本相同。所有实验过程均在光照阶段进行。4组各项特征如鼠龄、体质量等差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 实验开始前测量各组大鼠的行为学指标和空间记忆探索能力

采用旷场实验测量各组大鼠的跨格次数、站立次数及修饰行为评估其行为学指标，Morris水迷宫实验测量各组大鼠进入目标象限次数及穿越原平台位置次数以对其空间学习能力进行评估。

1.2.2 模型制备

采用2005年日本文部省召开的“基础和临床研究进展”国际会议确定的关于大鼠PTSD模型的方法-SPS法，包括以下3个步骤：连续束缚2 h、强迫游泳、乙醚麻醉。具体建模方法：将大鼠同时连续禁锢2 h，禁锢结束后取出并使其进行力竭式游泳(水温20℃)，直至大鼠放弃挣扎沉底30 s可视为力竭，然后使用99.5%乙醚将其麻醉10 s后大鼠出现呼吸急促，站立不稳，逐渐意识丧失，判断其角膜反射消失后即为麻醉成功，取出大鼠，将其置于通风处等待自然苏醒，然后对其足底施以不可逃避的电刺激(5 mV)，持续时间约 2 s，随机变化的间隔为30-120 s。电击步骤连续操作三日，且固定在每日同一时间内进行[7-8]。建模完成后，所有大鼠饲养于21-24℃安静环境中，保持昼夜节律、自由饮水摄食。空白对照组大鼠不加处理。

1.2.3复合应激完成后再次测量各组大鼠的行为学指标及空间学习能力

采用旷场实验测量各组大鼠的跨格次数、站立次数及修饰行为评估其行为学指标，Morris水迷宫测量各组大鼠进入目标象限次数及穿越原平台位置次数评估其空间学习能力，将两次测量结果进行对比，评估模型制备是否成功。

1.2.4 标本采集

将应激组标记好的大鼠分别于第1、4、7天断头取脑，正常组于第7天断头取脑，立即在冰台上分离海马组织，放入-80℃冰箱备用。

1.2.5逆转录酶-多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

所使用TRIzol试剂盒、cDNA合成试剂盒(Thermo Script TM RT-PCR System)、Taq DNA多聚酶均购置青岛捷世康生物科技有限公司。

采用TRIzol法提取海马组织总RNA，按照试剂盒说明书方法反转录为cDNA，进行PCR扩增，引物序列如下[9]：sense 5’-CGA AAT GAC CGG CTA CGT GG-3’，antisense5’- CAC TTC ATC GTA GGT CAG GC-3’，PCR 扩增条件：95 ℃-45 s，62℃-45 s，72 ℃-120 s，共 40个循环。20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用专用图像分析仪采集图像，以内参β-actin为基准计算目的基因的相对表达量。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法(Western blot)

按照RIPA裂解液说明书提取蛋白，Lowry法进行蛋白质定量。配制12%分离胶，5%浓缩胶，样品上样量为 5 μL(约 30 μg)，80V 电泳 30 min，120 V电泳至溴酚蓝胶底，转膜300 mA(60 min)，室温下封闭90 min，加一抗4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记山羊抗兔二抗(1∶1000)室温下孵育90 min，洗膜、BCIP/NBT显色。凝胶成像仪分析系统Image Labe软件对条带进行扫描后灰度值测定，目的蛋白条带与内参蛋白(β-actin)条带吸光度比值使用X±S表示目的蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量数据采用X±S描述，大鼠行为学指标使用Wilcoxon秩和检验，RT-PCR及Western blot数据与对照组比较采用t检验，以P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 评估动物模型制备效果

复合应激后大鼠的跨格次数、站立次数、修饰行为减少，焦虑情绪明显(表1)，其空间学习记忆明显降低(表2)，表明动物模型制备成功。

表1 大鼠旷场试验评分 n=32Tab.1 The test score of rats in Open-Field

表2 大鼠水迷宫空间探索实验 n=32Tab.2 The test score of rats in Water maze

2.2 Western blot结果

图1 各组大鼠海马区p-p38MARK表达Western blot电泳条带图Fig.1 The expression of p-p38MARK in hippocampus of each group detected by Western blot

P-p38MARK的分子量为43 kb，条带清晰。以β-actin的吸光度值作为内参照，对各组条带的吸光度值进行校正和半定量分析。PTSD1d组、4 d组大鼠海马区P-p38MARK表达与对照组相比未见统计学差异，7 d组与对照组差异具有统计学意义(P<0.05)(图 1、图 2)。

图2 各组大鼠海马区P-p38MARK吸光光度值比较Fig.2 Comparison of Spectrophotometric Values of P-p38MARK in Hippocampus of Rats

2.3 RT-PCR结果

对照组与1 d组、4 d组差异未见统计学意义，7 d组与对照组差异具有统计学意义 (表3、图3)。

表3 大鼠p38MAPK RT-PCR产物表达量 ±STab.3 Product expression of Rats p38MAPK RT-PCR

表3 大鼠p38MAPK RT-PCR产物表达量 ±STab.3 Product expression of Rats p38MAPK RT-PCR

注：与对照组比较。

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图 3 大鼠p38MAPK RT-PCR产物表达量(相对光密度)Fig.3 Product expression of Rats p38MAPK RT-PCR(Relative optical density)

3 讨论

本实验采用SPS作为应激动物模型制备方法，可使实验动物出现创伤后应激的临床核心症状和神经内分泌的改变，是国际上公认的应激动物模型[10]。本实验应用SPS应激诱发了大鼠活动习性明显改变，并使其获得对恐怖情景的记忆，符合创伤应激后的主要临床表现，提示模型制备成功。

本实验结果显示，创伤后应激大鼠p38MAPK在应激后7 d左右开始升高，提示PTSD大鼠海马区出现p38MAPK信号途径被激活，p38 MAPK mRNA转录上调，p38 MAPK蛋白合成增多，而大鼠应激后出现学习记忆能力下降可能与此机制有关。这与王毅鑫等[6]对创伤后患者白细胞中p38MAPK的研究结果相似。

PTSD对记忆损害最显著特征是闯入性记忆(intrusive memory)，表现为无法控制地回想创伤场景，自发提取创伤性事件信息的每一个成分：如声音、颜色、情景等，进而引发创伤再体验，并伴随持续、重复、强烈的精神痛苦。这种闯入性记忆会导致患者警觉性水平的持续性升高，常常表现出持续性的回避行为，这是PTSD症候群中最为核心的症状，也是PTSD与其他应激障碍最重要区别点。闯入性记忆本质上可能与脑内核团的某些神经环路有关[11]。在动物试验中已证明，作用于杏仁核的强刺激会影响海马的功能，提示强烈的情绪可能抑制对信息的评估及归类过程再应用层面[12]。海马的主要功能是提取和回忆与时间、空间有关的信息，是大脑的资料库，与多个脑区有着广泛的纤维联系，将各种传入感觉信息整合成为有条理的信息后返回皮质，并形成记忆，是参与陈述性记忆、工作记忆、情节记忆的重要脑区，海马结构对应激非常敏感。

国内外大量研究证明PTSD患者的海马体积存在一定程度的改变。有研究者运用影像学技术对越战老兵PTSD患者进行研究发现，其右侧海马体积比对照组缩小8%，左右两侧海马分别缩小26%和22%，且PTSD症状的严重程度与海马缩小的程度可能相关；文敏等[13]对成人PTSD患者的Meta分析表明其左、右侧海马体积均减小，本课题组人员陆可可[14]发现创伤后应激障碍患者海马旁回灰质体积/密度小于创伤暴露的对照组。海马功能的损害与PTSD患者学习及记忆下降密切相关。

p38MAPK信号途径是MAPK家族中重要的组成部分[15]，p38MAPK不仅与应激、损伤、炎症密切相关，同时参与细胞存活、分化、发育和细胞凋亡，p38MAPK位于胞浆内，被磷酸化后形成p-p38MAPK，进入细胞核内磷酸化核转录因子，调节基因转录，促进一些特定基因的表达，如TNF、IL-1β及COX等炎症因子合成及释放，从而引起细胞增殖、分化及凋亡，诱导p38-caspase促凋亡通路。国内学者已证实，血管性痴呆大鼠学习记忆能力与p38MAPK密切相关[5]。杨申等[16]进一步研究证实P38MAPK通路可能通过调控凋亡因子Bcl-2和Caspase-3的表达影响血管性痴呆大鼠学习记忆能力。因此，p38MAPK与许多神经系统疾病，如血管性痴呆、癫痫、阿尔海默兹病等关系密切。刘智良等[17]研究发现，通过抑制p38MAPK信号通路可对海马神经元的毒性损害产生保护作用。胡亚卓等[18]发现，多奈哌齐可通过抑制海马区p38MAPK信号通路而提高血管性痴呆模型动物的学习记忆成绩。郭霞[19]等研究证实p38 MAPK参与了睡眠剥夺后认知功能损伤病理过程。

综上所述，p38MAPK在创伤后应激大鼠海马区表达增强，在随后的实验中，将进一步结合免疫组化实验，对PTSD组海马损伤情况进行研究。Bcl-2蛋白作为一重要的抗调亡蛋白，大量的研究表明了在各种预处理及后处理对脑组织的保护作用机制中起着重要的作用，有文献显示其表达受p38磷酸化程度的调控，进而调控细胞调亡。由于实验条件限制，未能同步观察Bcl-2表达情况，将在后续实验中完善，进一步探讨PTSD影响学习记忆变化的分子学机制。

[1]薛辰霞.创伤后应激障碍患者的情绪及相应脑区功能变化的研究[D].石河子：石河子大学，2016.

[2]Kristina J K，Nicholas P A，Daniel F G，et al.Differential treatment response trajectories in individuals with subclinical and clinical PTSD[J].Journal of Anxiety Disorders，2016，10(4):26-33.

[3]Mulner L O，Chassé H，Morales J.MAPK/ERK activity is required for the successful progression of mitosis in sea urchin embryos[J].Developmental Biology，2016，21(4):194-203.

[4]Colin N，Stéphanie B，Maiva G.Plasma membrane reorganization links acid sphingomyelinase/ceramide to p38 MAPK pathways in endothelial cells apoptosis[J].Cellular Signalling，2017(33):10-21.

[5]王雪笠，吕佩源，陶冉,等.血管性痴呆小鼠海马p38 MAPK的表达及其意义 [J].中国神经精神疾病杂志，2008，3(2):83-86.Wang X L，Lv P Y，Tao R.et al.Expression of p38 MAPK in hippocampusofMicewith vasculardementiaand its Significance[J].Chinese Journal of Nervous and Mental Diseases，2008，3(2):83-86.

[6]王毅鑫，苏文利，杨兴易,等.创伤患者p38MAPK活化和炎症因子表达的变化[J].中国急救医学，2008，10(5):399-402.Wang Y X，Su W L，Yang X Y.et al.Changes of p38MAPK activation and expression of inflammatory factors in traumatic patients[J].Chinese Journal of Critical Care Medicine，2008，10(5):399-402.

[7]晋翔，王文，王化宁,等.创伤后应激障碍大鼠模型的建立及其有效性探讨[J].转化医学杂志，2013，3(2):73-76.Jin X，Wang W，Wang H N,et al.Establishment of rat model of post-traumatic stress disorder and its effectiveness[J].Translational Medicine Journal，2013，3(2):73-76.

[8]赵中兴，伍亚民.一种新的大鼠创伤后应激障碍模型的建立及其行为学检测 [J].第三军医大学学报，2012，7(10):928-932.Zhao Z X，Wu Y M.Establishment of a new rat posttraumatic stress disorder model and its behavioral[J].Journal of Third Military Medical University，2012，7(10):928-932.

[9]Zhang H J，Zhang S H，Wang J.Wheat bran feruloyl oligosaccharides protect against AAPH-induced oxidative injury via p38MAPK/PI3K-Nrf2/Keap1-MafK pathway[J].Journal of Functional Foods，2016(29):53-59.

[10]王芳.PTSD大鼠模型的实验研究 [J].中风与神经疾病杂志，2012，10(1):80-81.Wang F.Experimental study on PTSD rat model[J].Journal of Apoplexy and Nervous Diseases，2012，10(1):80-81.

[11]Wen W，Sheng X W，Yun Q L.Department of anatomy systemic administration of NMDA receptor antagonist，MK801 impairs consolidating extinction of auditory conditioned fear in a pavlovian model[J].Shanghai Institutes for Biological Sciences，2009，8(8):744-752.

[12]Asgari A，Semnanian S，Atapour N.Low freq uency electrical stimulation enhances the effectiveness of phenobarbital on GABA ergic currents in hippocampal slices of kindled rats[J].Neuroscience，2016(5):330-335.

[13]文敏，周波，张春林.成人创伤后应激障碍海马体积研究的Meta分析[J].中国神经精神疾病杂志，2011，30(11):662-666.Wen M，Zhou B，Zhang C L.Meta-analysis of hippocampal volume in post-traumatic stress disorder in adults[J].Chinese Journal of Nervous and Mental Diseases，2011，30(11):662-666.

[14]陆可可.创伤后应激障碍患者记忆损害及相应脑区功能变化的研究[D].石河子:石河子大学，2016.

[15]Ge J，Liu Y，Li Q.Resveratrol induces apoptosis and autophagy in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt/mTOR and activating p38-MAPK[J].Biomedical and Environmental Sciences，2013(11):902-911.

[16]杨申.P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表达及其学习记忆能力的影响[D].济南:山东大学，2013.

[17]刘智良.红藻氨酸对大鼠海马p38MAPK活性及海马神经细胞形态和电生理的影响[D].广州:第一军医大学，2004.

[18]胡亚卓.盐酸多奈哌齐对血管性痴呆小鼠海马细胞外信号调节激酶表达变化的影响[D].石家庄:河北医科大学，2007.

[19]郭霞，陈长香，陈桂芝,等.睡眠剥夺对大鼠海马区磷酸化p38MAPK 表达的影响[J].四川大学学报(医学版)，2011，30(2):237-240.Guo X，Chen C X.et al.Effects of sleep deprivation on phosphorylated p38MAPK expression in hippocampus of rats[J].Journal of Sichuan University(Medical Science Edition)，2011，30(2):237-240.

Changes of p38MAPK in hippocampus of Rats after Post-travmatic stress

Pang Yuting,Xing Wenlong,Zhang Guiqing*
(Department of Psychology and Rehabilitation,the First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To investigate the changes and significance of p38MAPK in hippocampus of post-traumatic stress rats.Wistar rats were randomly divided into 4 groups:control group,PTSD 1d group,PTSD 4d group and PTSD 7d group,8 rats in each group.PTSD group was used to establish SPS model.The behavioral indexes of the rats were measured by open field experiment and Morris water maze.The reverse press of p38MAPK in hippocampus was detected by RT-PCR and Western blot.The results showed that the levels of p38MAPK in the hippocampus of rats after stress were significantly increased(P<0.05).The conclusion is that the increase of p38MAPK in the hippocampus of rats with post-traumatic stress disorder may lead to the loss of learning and memory function.

Stress;mitogen-activated protein kinase;immunoblot;hippocampus

R363

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.010

1007-7383(2017)05-0580-05

2017-05-12

新疆兵团医药卫生重点领域科技攻关项目(2012BA023)

庞雨婷（1990-），女，硕士研究生，专业方向为医学心理学。

*通信作者：张桂青（1965-），女，教授，主任医师，从事心理障碍的咨询与治疗，e-mail:firstli@126.com。