蔷薇红景天对大鼠脑缺血的保护作用研究

陈娟 ，张珂 ，李国玉 ，梁旭 ，刘秋怡 ，黄健 ，王航宇 ，王金辉 ，2*

（1石河子大学药学院/新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子 832000;2沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳110016）

蔷薇红景天对大鼠脑缺血的保护作用研究

陈娟1，张珂1，李国玉1，梁旭1，刘秋怡1，黄健1，王航宇1，王金辉1，2*

（1石河子大学药学院/新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子 832000;2沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳110016）

为观察蔷薇红景天对大鼠局灶性脑缺血模型的保护作用。采用Longa改良线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，通过观察大鼠脑组织病理切片，免疫组化，脑指数等指标，以及测定MDA、NO、GSH-PX、LD、Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶的含量和SOD、NOS的活性，判断大鼠脑缺血情况及蔷薇红景天对大鼠脑缺血模型的保护作用，利用分子对接技术进一步阐述蔷薇红景天对大鼠脑缺血保护作用的机制。结果显示，蔷薇红景天能够显著降低大鼠血清中的MDA、NO、NOS和脑组织中LD的含量；显著升高血清中的SOD及脑组织中的GSH-PX、Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶的含量；与模型组相比，各给药组的脑指数均有显著降低，从HE染色和免疫组化的图片来看，各给药组的脑缺血情况都有所改善，从分子对接的结果来看，主要是通过蔷薇红景天中化合物3、6、9、11、13、14对大鼠脑缺血起保护作用。由此可知，蔷薇红景天对大鼠局灶性脑缺血模型有一定的保护作用。

蔷薇红景天；MCAO；免疫组化；HE染色；脑指数

蔷薇红景天（Rhodiola roseaL.）为景天科红景天属植物，多年生草本或亚灌木植物。红景天的生物活性显著，经过研究发现红景天对中枢神经系统具有较强的双向调节作用，对心血管系统、代谢系统，内分泌系统等都具有极好的调理作用，具有较好的抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤、抗辐射、提高免疫力等作用，是一种珍贵的天然药物[1-3]。本文主要探讨蔷薇红景天的抗脑缺血作用，缺血引起的生理变化有很多，其中主要的有炎性细胞增多，自由基增多，脂质过氧化物增多，细胞凋亡坏死，减轻缺血症状就主要从这几方面下手，蔷薇红景天的化学成分主要包括红景天苷，酪醇，山奈酚，没食子酸，草质素，β-谷甾醇，胡萝卜苷，槲皮素，络塞维、络塞定等，其中红景天苷、山奈酚、草质素、络塞定、络塞维有很好的抗氧化抗炎作用。研究蔷薇红景天对脑缺血的保护作用，为临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠120只，雄性，体重 (210±20)g，购买于新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，许可证号：SCXK（新）2011-0001。

1.2 实验药品

蔷薇红景天根茎70%乙醇部位提取物，本实验室提取，尼莫地平片（山东健康药业有限公司，批号20150611）。

1.3 试剂与仪器

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、乳酸（LD）、Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测定试剂盒，均由南京建成生物试剂有限公司提供。抗体Rabbit Anti-BCL-2，Rabbit Anti-NOS1，Rabbit Anti-BAX均由博士德生物工程有限公司提供。BL-420生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司。Themo 3001全自动多功能酶标仪，美国Themo公司。UV-2600紫外分光光度计，日本岛津公司。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（T8170，北京索莱宝科技有限公司）。

1.4 试验方法

将健康大鼠分为6组，每组20只，分别为空白组、模型组、蔷薇红景天低剂量组（50 mg/kg）、蔷薇红景天中剂量组（100 mg/kg）、蔷薇红景天高剂量组（200 mg/kg）和阳性药组尼莫地平片（10 mg/kg），各给药组连续灌胃给药7 d，每天1次，空白组和模型组灌胃等体积的生理盐水。

按照Longa[3]改良线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉阻塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，于灌胃的第六天将大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，仰卧固定于手术台上，将颈部消毒后颈正中开口，分离左侧颈总动脉 (Common carotid artery，CCA)，将CCA用一号线结扎，分离颈内动脉(Internalcarotid artery，ICA)和颈外动脉(External carotid artery，ECA)，将 ECA 脉结扎，用微动脉夹将ICA夹住，于Y字分叉路口2 mm处用眼科剪剪一个小口，从此处鱼线进入ICA，将微动脉夹去掉，进线长度为距Y字分叉口18 mm或者感觉有阻力就停止进线，到大脑中动脉的起始部，即可闭塞MCA，造成可靠的梗死灶，然后缝合皮肤[4-6]。空白组只开口分离颈总动脉部结扎进线。术后缝合大鼠颈部切口皮肤，放回原环境饲养。各组大鼠缺血23 h后灌胃，然后灌胃1 h后立即由腹主动脉取血，采集血液标本。取血后，断头，低温快速取脑，待测各项指标。

1.5 液相色谱-质谱联用技术

（1）液相色谱条件

色谱柱：ScienhomeKromasilC18 column (4.6 mm×200 mm，5 μm。柱温：30 ℃。流速：1 mL/min，进入质谱前用三通10∶1分流。流动相：甲醇-乙腈-1%甲酸水梯度洗脱(表1)。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution corditions

（2）质谱条件

离子模式：ES+/ES-交互模式；质谱类型：TOF-MS；飞行模式：V mode；离子范围：100-1400 da；毛细管电压：1500.0；锥孔电压：100.0；脱溶剂温度：180；离子源温度：100；锥孔氮气流量：10 L/hr；脱溶剂氮气流量：450 L/hr；MCP 检测器电压：2150.0；离子自动衰减倍数：23.000；精确质量数内标物：200 pg/μL亮氨酸脑啡肽，选用13C同位素峰(A+1)+，精确质量数为557.2802。

1.6 统计方法

实验数据使用SPSS17.0统计分析软件ANOVA进行方差分析，数据结果以均值加减标准偏差（X±S）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑指数的影响

与空白组相比，脑缺血模型组脑指数显著增加（P<0.01），表明大鼠脑缺血后可引发脑水肿。与脑缺血模型组相比，蔷薇红景天低、中、高剂量组脑指数明显降低（P<0.01），其作用效果与阳性药组相当（图1）。

图1 脑指数Fig.1 Brain index

2.2 大脑TTC染色

大脑TTC染色结果见表2和图2。

表2 脑梗塞率的影响 n=8，X±STab.2 Effect ofRhodiola RoseaL.on cerebral infarction in different experimental groups of cerebral ischemia rat

脑缺血24 h后，空白组没有梗塞，模型组与空白组相比有明显的梗塞（P<0.01）。与模型组比较，蔷薇红景天低、中、高剂量组的梗塞率明显降低（P<0.05或P<0.01），说明蔷薇红景天对脑缺血有保护作用，作用与阳性药作用效果相当（表2，图2）。

图2 大脑TTC染色Fig.2 TTC staining of the brain

2.3 脑组织 GSH-PX、LD、Na-K ATP酶、Ca-Mg ATP酶的测定

与空白组相比，脑缺血模型组脑组织GSH-PX的含量和Na-K ATP酶、Ca-Mg ATP的活性显著降低（P<0.05或P<0.01），LD含量显著升高（P<0.05或P<0.01）。

与脑缺血模型组相比，蔷薇红景天的低、中、高剂量组脑组织GSH-PX的含量和Na-K ATP酶、Ca-Mg ATP的活性显著升高（P<0.05或P<0.01），LD含量显著降低（P<0.05或P<0.01），其中蔷薇红景天高剂组GSH-PX、蔷薇红景天低、中剂量组LD、蔷薇红景天中、高剂量组Ca-K ATP酶的作用效果比阳性药尼莫地平片要好（表3）。

表3 脑组织GSH-PX、LD、Na+k+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶的影 n=10，X±S Tab.3 Effect ofRhodiola roseaL.on GSH-PX、LD、Na+K+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase levels in different experimental groups of cerebral ischemia rat

2.4 病理组织形态学观察

从HE染色结果来看，空白组大鼠脑组织未见水肿，未见脑缺血病变，脑缺血模型组大脑白质神经纤维明显脱离髓鞘，灶状脑组织坏死，胶质细胞增生浸润，有明显的脑水肿，说明MCAO模型复制成功。蔷薇红景天低、中、高剂量均可有效改善大鼠脑缺血情况，其中中剂量作用效果最好（图3）。

图3 脑组织HE染色的影响（×200）Fig.3 Effect of HE staining in brain tissue(×200)

2.5 免疫组化分析

用Image-Pro Plus软件分析免疫组化图片，各给药组分别选取5个视野，比较模型组与其他给药组的累积光密度（IOD）。与正常组相比，BAX、BCL-2、Caspase-3和NOS1的模型组都存在极显著性差异；与模型组相比，BCL-2、Caspase-3和NOS1的给药组均存在显著性差异；BAX的阳性药组不存在差异，其他给药组均存在显著性差异（表4，图4）。

表4 脑组织免疫组化的影响 n=5，X±STab.4 Effect ofRhodiola roseaL.on immunohistochemistry in different experimental groups of cerebral ischemia rat

图4 蔷薇红景天对大鼠脑缺血脑组织的免疫组化着色（×200）Fig.4 Effects of RRL on the levels of BCL-2 in myocardial tissues of Iso-induced acute myccardial ischemia rat

2.6 血清 SOD、NOS活性及 MDA、NO 含量的测定

与空白组相比，脑缺血模型组血清SOD活性明显降低，而 MDA、NO含量和NOS活性明显升高（P<0.05或P<0.01），表明脑缺血时可产生自由基和NO导致脑组织损伤。与模型组相比，蔷薇红景天低、中、高剂量组血清SOD活性显著升高（P<0.05或P<0.01），MDA、NO含量和 NOS活性显著降低（P<0.05或P<0.01），其作用效果与阳性药组作用效果相当（表 5）。

表5 血清SOD、NOS活性及MDA、NO含量的影响n=10，X±STab.5 Effect ofRhodiola RoseaL.on SOD、NOS、MDA and NO levels in different experimental groups of cerebral ischemia rat

2.7 血浆中得到的化合物

通过UPLC-TOF-MS分析方法，对血浆样品进行成分定性分析和鉴定，检测出了15个蔷薇红景天提取物中的化合物（图 5，表 6，图 6）。

图5 给药后1 h血浆的UPLC-TOF-MS总离子流色谱图和选择离子流色谱图Fig.5 UPLC-TOF-MS total ion flow chromatograms of 1 h plasma and selected ion flow chromatograms from top to bottom after administration

表6 给药1h后血浆中分析得到的化合物Tab.6 Analysis of compounds obtained in plasma after 1 hours of administration

图6 给药后1 h血浆中得到的化合物Fig.6 Compounds obtained in 1 h plasma after administration

2.8 分子对接

分析了蔷薇红景天对大鼠脑缺血脑组织免疫组化（BAX、BCL-2、Caspase-3 和 NOS1）的影响，并在血浆样品中检测到了15个化合物，采用分子对接技术，用这些化合物与Caspase-3和BCL-2蛋白进行对接，进一步阐述蔷薇红景天对大鼠脑缺血的保护作用。

Caspase-3蛋白（PDB ID：1GFW）以 PFAYCUAUB OGVDX-AWEZNQCLSA-N（抑制剂）作为阳性药，确定Caspase-3蛋白活性位点，并与血浆样品中检测到的化合物进行对接，用化合物与蛋白的结合能作为评价指标（表7），数值越大说明结合能力越强。此外，化合物与蛋白结合时形成的氢键也可作为评价指标（表8），形成氢键说明结合稳定。化合物3、5、6、9、11、13、14 的与 Caspase-3 蛋白的结合能力超过阳性药，分别与氨基酸残基THR62、SER63、SER65、HIS121、GLY122、CYS163、TYR204、SER205、ARG207、ASN208、SER209、PHE250、SER251 形成 5、6、2、3、5、7、10个氢键，说明蔷薇红景天是通过这些化合物对大鼠脑缺血起保护作用。

BCL-2蛋白（PDB ID：4IEH）以 IXACTXFUQMBZ JI-MGBGTMOVSA-N（抑制剂）作为阳性药，确定BCL-2活性位点，进行分子对接，化合物与蛋白的结合能（表9）与氢键（表10）作为评价指标评价同上。阳性药及化合物 3、6、9、11、13、14 与蛋白的结合能力相近，化学结构近似，分别与氨基酸残基ALA59、ARG66、TYR67、ASP70、ASN102、AYG105、TYR161 形成 3、2、1、2、3、4 个氢键，说明蔷薇红景天是通过这些化合物对大鼠脑缺血起保护作用。

综上所述，蔷薇红景天作用于SD大鼠，通过从血浆样品中检测到的化合物与Caspase-3和BCL-2进行对接，发现主要通过化合物 3、6、9、11、13、14对大鼠脑缺血起保护作用。

表7 化合物与Caspase-3蛋白活性位点的结合方式以及结合能Tab.7 Binding modes and binding energies of compounds with active sites of Caspase-3 proteins

续表7

表8 化合物与Caspase-3蛋白相互结合的氢键作用Tab.8 Hydrogen bonding between compounds and Caspase-3 proteins

表9 化合物与BCL-2蛋白活性位点的结合方式以及结合能Tab.9 Binding modes and binding energies of compounds with active sites of BCL-2 proteins

续表9

表10 化合物与Caspase-3蛋白相互结合的氢键作用Tab.10 Hydrogen bonding between compounds and Caspase-3 proteins

3 讨论

脑缺血是危害人类健康的严重疾病，防治脑缺血疾病成为一项重要的研究项目。缺血性脑损伤机制非常复杂，是由于大脑缺血缺氧造成的脑细胞损伤，细胞的结构和功能发生改变，细胞内外离子失衡，能量代谢紊乱引起的[7]。大脑发生缺血时毛细血管通透性就会增大，血管内的水分、血浆外渗，造成脑水肿。蔷薇红景天各给药组脑指数与模型组相比都明显降低，说明其能够抑制血管的通透性，减少血管内液体外渗。TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，最初检测种子生存能力，后来用于染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。TTC是呼吸链中吡啶核苷结核酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应生成红色，而缺血组织细胞内脱氢酶活性衰退下降，不能反应，因此不会产生变化而呈现白色[8]。从实验结果来看，蔷薇红景天能够缩小脑梗面积，其机制可能是蔷薇红景天能够提高脱氢酶活性。

当大脑发生缺血时引起生物膜系统脂质过氧化反应，产生大量自由基，SOD和GSH-Px能够清除有害自由基，故而减轻大脑受损程度。氧自由基与多价不饱和脂肪酸反应形成脂质过氧化物，会对细胞多种成分造成损伤，引起细胞结构和功能的改变，脂质过氧化物的主要产物是MDA[9]。NOS催化左旋精氨酸生成 NO，NO与超氧阴离子反应生成超氧亚硝酸根离子，其降解为OH-和 NO-2自由基，使细胞膜发生脂质过氧化反应，引起强烈的神经毒性，甚至可以导致神经元死亡；大量NO可导致大量多巴胺释放，引起神经细胞损伤[10-11]。提示蔷薇红景天通过清除氧自由基，减少脂质过氧化物的产生，清除超氧阴离子抑制神经毒素的释放来减轻脑损伤程度，其具有较好的抗氧化和清除自由基的功效。

大脑缺血缺氧还会造成能量衰竭，积累大量LD，抑制线粒体的呼吸功能，导致细胞内ATP逐渐耗竭，依靠ATP转运的离子泵因能量代谢障碍而受抑制，又因为Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性降低，导致Na+和 Ca+2超载，引起脑细胞损伤[12]。从实验结果来看，蔷薇红景天能够有效减少乳酸的积累，提高Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶的活性，其作用机制可能是蔷薇红景天能够降低脑组织的能量代谢，耗氧量。

近年来，研究表明细胞凋亡在脑缺血中有一定的作用，BCL-2是一种凋亡因子[13]，BAX是BCL-2家族的一个成员，BAX是与BCL-2同源的水溶性相关蛋白，是BAX基因家族中细胞凋亡促进因子。BCL-2过渡的表达可拮抗BAX的保护效应使细胞趋于死亡[14]。在正常的心肌细胞中BAX表达少[15]，BLC-2而表达相对较多。NO是一种有内皮细胞分泌产生的舒张血管的物质[16]，可在哺乳类动物内神经细胞内经NOS1催化生成。NO能排除大量的氧自由基，两者发生反应生成ONOO－，使蛋白质、核酸及细胞膜损伤，导致脑细胞死亡[17]。从免疫组化的图片来看，模型组NOS1表达量最多，其他各给药组均有所降低。Caspase家族是细胞凋亡的主要调控基因，有研究表明，局灶性脑缺血会激活Caspase-3[18-19]，空白组表达很少，模型组大量表达，其他给药组与模型组相比均有降低。提示蔷薇红景天能够抑制细胞凋亡促进因子的生成，减少细胞凋亡，抑制ONOO－的生成，减少细胞死亡，从而实现对大鼠脑缺血的保护作用。从整个实验结果来看，给药剂量与结果不存在对应关系，有的是中剂量结果最好，有的是高剂量结果最好，在以往的实验过程中也出现过，查阅文献也暂时找不到原因，但是综合比较，还是蔷薇红景天高剂量组效果最好。

从灌胃后1 h的大鼠血浆中检测出15个蔷薇红景天中的化合物，然后分析了蔷薇红景天对大鼠脑缺血脑组织免疫组化（BAX、BCL-2、Caspase-3和NOS1）的影响，采用分子对接技术(Molecular Docking Method)[20-22]，用这些化合物与 Caspase-3和BCL-2蛋白进行对接，从计算结果来看，化合物3、5、6、9、11、13、14与受体蛋白 Caspase-3有较好的相互作用，化合物 3、6、9、11、13、14 与受体蛋白 BCL-2 有较好的相互作用。Caspase-3和BCL-2蛋白都与细胞凋亡相关，脑缺血会造成脑水肿，细胞坏死和凋亡，研究发现化合物 3、6、9、11、13、14 与 Caspase-3 和BCL-2蛋白能够成功进行分子对接，其对接位点的信息对分析该类化合物抑制Caspase-3和BCL-2的活性机制以及蔷薇红景天用于脑缺血的治疗提供了一定的研究依据。

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Protection ofRhodiola roseaL.against focal cerebral ischemia in Rats

Chen Juan1,Zhang Ke1,Li Guoyu1,Liang Xu1,Liu Qiuyi1,Huang Jian1,Wang Hangyu1,Wang Jinhui1,2*
(1 School of Pharmacy,Shihezi University/key Laboratory of Xinjiang special plant resources,Shihezi,Xinjiang 832000,China;2 Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang,Liaoning 110016,China)

To investigate the protection ofRhodiola roseaL.on focal cerebral ischemic injury in rats.The middle cerebral artery occlusion (MCAO)in rats was adopted to establish cerebral ischemia model by Longa methods,which was validated by observing the histopathology slide,immunohistochemical markers anddetermining MDA,SOD,NO,NOS,GSH-PX,LD,Na+K+-ATPase and Ca2+-Mg2+ATPase.The mechanism of protective effect ofRhodiola roseaL.on cerebral ischemia in rats was further studied by using molecular docking technique.The results showed thatRhodiola roseaL.Significantly decreased the content of MDA,NO in serum of rats and LD in brain tissue of rats;The level of NOS and SOD was significantly increased in the serum tissue of rats and significantly increased the content of GSH-PX,Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in brain tissue of rats.Compared with the model group,the brain index of each treatment group was significantly lower;By HE staining and immunohistochemistry,there was a significant improvement in the degree of cerebral damage in the other groups compared with model group.It can be concluded that theRhodiola roseaL.has some kind of protective effect on the focal cerebral ischemic injury in rats.From the result of molecular docking,the protective effects of compound 3,6,9,13,11 and 14 on cerebral ischemia are observed inRhodiola roseaL.

Rhodiola roseaL.;MCAO;immuno histochemistry;HE staining;brain index

R793.9

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.012

1007-7383(2017)05-0590-12

2017-01-31

国家科技支撑计划项目(2012BAI30B02)

陈娟（1990-），女，硕士研究生，专业方向为蔷薇红景天药理活性研究。

*通信作者：王金辉（1972-），男，教授，从事中药物质基础研究，e-mail:tcm_syphu@163.com。