棉纤维醛酮还原酶基因促进拟南芥主根伸长

杨洋,李鸿彬*

（石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆 石河子832003）

棉纤维醛酮还原酶基因促进拟南芥主根伸长

杨洋,李鸿彬*

（石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆 石河子832003）

为了研究棉纤维醛酮还原酶基因在参与细胞伸长发育中所起的作用，本研究利用RT-PCR技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到棉花醛酮还原酶(aldo/keto reductase，AKR)基因cDNA，该基因全长读码框为1134 bp，编码377个氨基酸。氨基酸序列生物信息学分析表明GhAKR蛋白具有较高的保守性，包含氧化还原酶、醛酮还原酶结合位点和跨膜信号序列等功能序列和位点；进化树分析显示GhAKR与可可（TcAKR）的亲缘关系较近。qRT-PCR和酶活性分析表明GhAKR基因与纤维细胞的快速伸长发育密切相关，尤其在开花后5-15 d纤维快速伸长发育时期具有较高的表达。构建35S::GhAKR过量表达载体并转化野生型拟南芥（哥伦比亚生态型），转基因拟南芥的主根伸长发育获得了显著的促进，与野生型相比，转基因拟南芥主根伸长增加了约1.4倍。拟南芥根中甲醇和乙醇含量分析显示，转基因拟南芥根中具有较高的甲醇和乙醇积累。这些结果表明棉纤维GhAKR基因与纤维细胞伸长发育联系紧密，可能通过增加细胞内的醇含量进一步促进细胞的伸长。本研究可为棉花GhGAKR基因参与纤维伸长发育分子机制解析，以及利用基因工程培育优质棉花品种提供一定参考。

棉花纤维；醛酮还原酶；拟南芥；细胞伸长；醇含量

棉花是全球重要的经济作物，棉纤维由无分支的长单细胞组成，纤维细胞的长度和强度决定着纤维的品质，棉纤维的发育与细胞的氧化还原关系密切。生物体中含有大量的氧化还原酶系，可促进细胞中糖类、醛类等各类物质发生氧化还原反应，从而促进细胞的生长发育[1]。

醛酮还原酶(aldo/keto reductase，AKR)属于氧化还原酶系中的一员，能对很多羧基底物进行氧化还原[2-3]。醛酮还原酶通常都是单体，约含320个氨基酸残基，大小约为35 kDa，其催化底物广泛，包括脂肪族和芳香族的醛基、酮基、单糖、类固醇、前列腺素等。AKR成员均属于单体胞质蛋白，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (Nicotinamide-adeninedinucleotide phosphate，NADPH)作为其辅酶，将醛酮类化合物还原成相应的醇类[4-7]，在生物体中发挥重要作用。目前，醛酮还原酶基因的研究多见于动物细胞和人类中的工作[8]。研究表明，醛酮还原酶及其同工酶可能有许多重要的生理功能，尤其是参与细胞生长和分化的调控[9]；此外，还参与调节渗透作用、细胞中有毒物质的代谢等[10-11]。

醛酮还原酶的生理作用在植物中的研究相对较少，植物AKR成员大多数属于AKR4家族的AKR4C亚家族。有研究结果表明，AKR4C参与植物细胞对环境压力的耐受。大麦胚胎中合成的AKR4C1，属于AKR4C亚家族的第一个成员，该蛋白质可能通过响应植物激素脱落酸(ABA)的诱导进一步增强植物细胞在脱水条件下的耐受性。

棉花纤维发育过程中AKR相关的研究鲜有报道，基于醛酮还原酶的酶学特性以及氧化还原反应在棉纤维发育过程中的重要作用，本研究从快速伸长的棉花纤维中克隆得到GhAKR基因，分析了该基因的表达特性，利用拟南芥研究了GhAKR基因在细胞伸长发育过程中的重要功能，以期为深入研究棉花醛酮还原酶基因参与细胞伸长发育的重要作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

陆地棉品种徐州-142为本实验室保存。凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq DNA 酶购自TIANGEN公司，RNA反转录试剂盒、限制性内切酶Sal I和 Xma I、4 DNA ligase购自 TaKaRa公司，Trizol购自Invitrogen公司，其他试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 GhAKR基因的克隆、氨基酸序列比对及进化树分析

采用改良的CTAB法，提取棉花开花各个时期纤维组织中的RNA[12-13]。将所提取的RNA反转录成cDNA，利用设计的特异性引物，选择Sal I和Xma I为酶切位点（表1，下划线所示），以反转录产物为模板进行PCR扩增克隆棉花GhAKR的基因全长ORF（表 1）。

PCR反应条件：95℃ 4 min；95℃ 30 s，65℃45 s，72 ℃ 1 min；30 次循环，72 ℃ 10 min，PCR 产物4℃存放。

通过www.expasy.org网站及NCBI网站的在线蛋白质序列分析程序和 DNAMAN软件完成序列的结构分析，用MEGA 软件进行蛋白质序列比对[14]。

1.2.2 GhAKR基因的表达特征分析.

利用CTAB法提取野生型陆地棉徐-142开花后 0、5、10、15、20、25 d 纤维样品和 5 d 突变体胚珠总的RNA，以RNA为模板反转录合成的cDNA作为qRT-PCR模板，根据设计的特异性引物（表1），以UBQ基因作为参照，每个样品设置3个重复，检测GhAKR基因的表达，利用2-△△Ct法对待测样品基因进行相对表达差异分析。

表1 使用的引物名称和序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.3 AKR的酶活力分析

取0.2 g野生型陆地棉徐-142开花后0、5、10、15、20、25 d纤维样品和5 d突变体胚珠分别提取粗酶液[15]，加入2 mL 预冷的50 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，转入2 mL离心管中，在4 ℃，12000 r/min，离心 15 min，收集上清液，使用100 g/L氢氧化钾溶液调节pH值为6。

取稀释至1 mL 5μg/mL的甲醛标准溶液，分别加入上述离心得到的上清液，静置反应30 min，加入1 mL配制好的乙酰丙酮溶液及1 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，用5 μg/mL的甲醛标准溶液混合1 mL乙酰丙酮溶液及1mL 100g/L的三氯乙酸溶液作为空白对照，沸水浴显色3 min，取出静置至室温，于412 nm波长处测定吸光度值。

醛酮还原酶活力计算公式：酶活力=△A412×V×K×1000/（T×ε×m）(mmol/min·5 μg/mL)

△A：反应液吸光度；V：反应液体积（mL）；K:稀释倍数；T：反应时间（min）；ε=0.016(μmol/L)-1；m：甲醛溶液（5 μg/mL）

1.2.4 拟南芥中甲醇和乙醇含量测定

取约10 g各种拟南芥材料置于蒸馏瓶中，分别加入15 mL蒸馏水、2 g氯化钠和25 mL乙醇，在沸水浴上蒸馏，收集蒸馏液约20 mL于100 mL容量瓶中加蒸馏水至刻度作为试样。取无水甲醇0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、5.0、7.5 mL 于 50 mL 容量瓶中，各加2.5 mL 98%乙醇，用蒸馏水定容至刻度，得到浓 度 为 0.01% 、0.02% 、0.03% 、0.05% 、0.07% 、0.10%、0.15%的系列标准溶液。取1 mL以上各种浓度的标准溶液于离心管中，分别加人0.15 mL 15%磷酸，0.2 mL 5%高锰酸钾，混匀，放置15 min。加2滴20% 亚硫酸钠，混匀；加入4 mL 60%硫酸，混合，加入0.3 mL 2%变色酸，于68-70℃水浴加热8 min，用冰水冷却后放置10 min，以纯水为参比，用l cm比色皿于580 nm波长处测定吸光度，制定标准曲线。甲醇含量通过对比标准曲线计算获得。

称取约10 g拟南芥材料，置于50 mL烧瓶中，加 20 mL蒸馏水，沸水浴加热蒸馏，取100 mL蒸馏出的液体，摇匀；吸取2 mL蒸馏得到的液体，加0.4 mL 2%重铬酸钾溶液、2 mL浓硫酸，摇匀。利用分光光度计在600 nm下测定吸光度值。绘制不同浓度乙醇的标准曲线，样品中乙醇含量计算参考标准曲线计算获得。

2 结果与分析

2.1 GhAKR氨基酸序列比对与系统进化树分析

用改良的CTAB法提取棉花纤维快速伸长发育时期组织（开花后5 d）的总RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用基因特异性引物扩增，获得棉花GhAKR基因全长ORF 1134 bp，该序列编码包含377个氨基酸的蛋白质。

将推定的GhAKR氨基酸序列与苹果（MdAKR）、南瓜（MeAKR）、烟草（NtAKR）、番茄（SlAKR）、可可（TcAKR）等植物的氨基酸序列进行比对，结果显示：棉花GhAKR氨基酸序列与其他植物AKR氨基酸序列相似性分别为：82%（苹果）、80%（南瓜）、80%（烟草）、79%（番茄）、83%（可可）。序列分析结果表明，GhAKR具有保守的醛酮还原酶家族序列，具有典型的功能结构域。如图1所示，GhAKR氨基酸序列中存在氧化还原酶结合位点和醛酮还原酶结合位点。疏水性分析表明棉花 GhAKR蛋白是1个跨膜蛋白，在N端1-49个氨基酸残基处存在跨膜区，跨膜螺旋存在于26-32氨基酸残基之间，1-13为跨膜信号的N端，43-46为跨膜信号的C端。进化树结果（图2）显示棉花GhAKR与可可（TcAKR）在进化上亲缘关系较近。

图1 棉花GhAKR氨基酸序列比对Fig.1 Amino acid sequence alignment of cotton GhAKR

图2 棉花GhAKR的进化树构建Fig.2 Phylogenetic tree construction of cotton GhAKR

2.2 GhAKR的表达特征分析

为了研究GhAKR基因参与棉花纤维发育的表达特征，利用qRT-PCR分析方法进行相对表达量分析，同时提取各组织材料的蛋白质进行酶活力分析。结果显示：在转录表达水平，GhAKR基因在开花后5-15 d的野生型纤维组织中相对表达量较高，尤其是在开花后5 d的纤维组织中表达量达到峰值；与纤维组织中的表达相比，GhAKR基因在5 d的fuzzless-lintless(fl)突变体组织中表达量较低（图3）。AKR酶活力变化趋势与其基因表达一致，在棉花纤维发育5 d时，AKR酶活力最高，而此时突变体中的酶活力较低。

图3 GhAKR在棉纤维不同发育时期的表达分析Fig.3 Analysis of expression pattern of GhAKRinvolved in cotton fiber developmental

2.3 GhAKR促进拟南芥主根的伸长发育

构建35S::GhAKR过量表达载体，转化野生型拟南芥，分别观察野生型和过量表达转基因拟南芥T2代株系的根系发育情况。结果（图4）显示：转基因拟南芥主根的伸长获得了显著的促进（图4A），与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥主根伸长增加了约1.4倍（图4B），说明GhAKR基因可以促进拟南芥主根的伸长，提示了GhAKR与细胞伸长发育之间的紧密联系。

图4 转基因拟南芥幼苗根长分析Fig.4 Root length analysis of WT and transgenic Arabidopsis seedlings

2.4 拟南芥中甲醇和乙醇含量测定

AKR能够将醛/酮催化为醇，研究[16-18]表明甲醇和乙醇对于植物的生长发育具有显著的刺激作用，因此本研究检测了转GhAKR基因拟南芥主根中甲醇和乙醇的含量，结果表明：转GhAKR基因拟南芥主根中甲醇和乙醇的含量均显著高于野生型拟南芥，说明GhAKR基因可以促进拟南芥主根中甲醇和乙醇的积累。这提示了棉花GhAKR基因可能通过促进甲醇和乙醇的积累来参与细胞发育，进而促进拟南芥主根的伸长（图5）。

图5 转基因拟南芥中甲醇和乙醇含量测定Fig.5 Determination of methanol and alcohol contents in transgenic Arabidopsis plants

3 讨论

在植物研究中，已有研究人员从番茄等物种克隆得到AKR基因[19-20]，并发现AKR基因参与植物细胞生长发育过程中的众多氧化还原反应，可增强植物对于干旱、冷压力以及高盐刺激的抵抗能力，也可促进植物细胞生长发育及代谢[21-22]。本研究从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到GhAKR基因，该基因编码377个氨基酸。GhAKR蛋白属于醛酮还原酶家族，拥有氧化还原酶结合位点、醛酮还原酶结合位点和跨膜信号肽等保守结构，暗示了GhAKR可能在植物体氧化还原反应以及细胞信息传递过程中发挥作用。GhAKR在棉花开后5 d（纤维细胞的快速伸长发育时期）的棉花纤维中的表达量较高，表明GhAKR与棉花纤维的发育具有密切联系，可能通过这些功能结构域催化的氧化还原反应进一步参与细胞发育。

甲醇和乙醇作为生物体中常见的醇类物质，在生物体的生长发育过程中发挥重要作用。其可作为信号分子物质通过诱导光合作用相关基因的表达来促进拟南芥的生长[16-18]。本研究构建35S::GhAKR过量表达载体并转化野生型拟南芥，发现过量表达的转基因拟南芥的主根发育获得了显著促进，转基因拟南芥主根长较野生型拟南芥增加了1.4倍，并且转基因拟南芥细胞内甲醇和乙醇的含量也获得了显著的增加，表明GhAKR可能通过促进细胞内醇含量的增加进一步促进拟南芥主根的伸长。棉纤维的发育是一个复杂的生理过程，本研究结果为棉纤维发育分子机制解析和进一步的基因工程利用提供了参考。

4 结论

本研究从野生型陆地棉徐州-142的纤维组织中克隆得到GhAKR基因，构建了35S::GhAKR过量表达载体并转化野生型拟南芥，检测了过量表达转基因拟南芥中甲醇和乙醇的含量。GhAKR基因在野生型棉花开花后5-15 d的纤维组织中具有较高的表达；过量表达转GhAKR基因拟南芥主根伸长获得显著促进，转基因拟南芥中甲醇和乙醇的含量显著增加。这些结果表明GhAKR基因可能通过催化氧化还原反应，促进细胞内醇类物质的积累进一步参与棉花纤维伸长发育。

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A cotton fiber aldehyde ketone reductase gene GhAKR promotes elongation of main root inArabidopsis thaliana

Yang Yang,Li Hongbin*
(College of Life Sciences,Key laboratory of Agrobiotechnology,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

In order to study the function of cotton fiber aldehyde/ketone reductase (AKR)gene and its role in cell elongation development,the full-length open reading frame(ORF)of GhAKR cDNA was cloned from fast elongating fiber tissues by RT-PCR,The length of GhAKR ORF contains 1134 bp nucleotides and codes a protein of 377 amino acids.Sequence analysis indicated that GhAKR is a conservative protein with a transmembrane signal peptide,functional sites of oxidoreductase and aldehyde/ketone reductase binding sites.Phylogenetic tree analysis showed that GhAKR has a close evolutionary relationship with TcAKR.Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)and enzyme activity analyses displayed that GhAKR is closely relevant to fiber fast elongation development with abundant expression at 5-15 day-post anthesis (dpa)wild-type (WT)ovule and fiber tissues.Transgenic Arabidopsis plants expressing 35S::GhAKR vector showed enhanced main root elongation with 1.4 fold increase than control.Methanol and alcohol were accumulated in roots of transgenic Arabidopsis plants.These results revealed that GhAKR is involved in fiber elongation through increasing the content of methanol and alcohol in the cell.The study provided a basis for further understanding of GhAKR participating in cell elongation and cotton genetic breeding.

cotton fiber;aldehyde ketone reductase;Arabidopsis thaliana;cell elongation;methol and alcohol

S562；Q943.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.015

1007-7383(2017)05-0612-06

2017-03-24

国家自然科学基金项目（31660408）、新疆兵团科技计划项目（2016AC017）和新疆兵团杰出青年项目（2014CD003）

杨洋（1991-），女，硕士研究生，研究方向为农业生物环境与能源工程，e-mail：1501927938@qq.com。

*通信作者：李鸿彬（1980-），男，教授，博士生导师，从事农业生物环境与能源工程研究,e-mail:lihb@shzu.edu.cn。