抗PUF60抗体在炎性肌病患者中的分布特点及临床意义

张亚妹 ，彭清林 ，王国春 ⋆

（1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.中日友好医院 风湿免疫科，北京 100029）

抗PUF60抗体在炎性肌病患者中的分布特点及临床意义

张亚妹1，彭清林2，王国春1⋆

（1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.中日友好医院 风湿免疫科，北京 100029）

目的：检测抗PUF60抗体在中国特发性炎性肌病（IIM）患者中的阳性率，并分析其相关的临床意义。方法本研究共纳入388例IIM患者[275例皮肌炎（DM）、76例多发性肌炎（PM）及37例肌炎-重叠综合征]和167例健康对照（HCs）。酶联免疫吸附测定（ELISA）测定入组患者及健康对照的抗体滴度，并联合免疫印迹实验验证ELISA结果的可靠性。结果抗PUF60抗体可见于各IIM亚组，阳性率均高于健康对照组，包括11.3%（P＜0.01）的DM、7.9%（P＜0.05）的PM和21.6%（P＜0.01）的肌炎重叠综合征患者。在经典DM中，该抗体常见于肌炎抗体阴性的患者（P＜0.05），并与技工手发生相关；且该抗体在无肌病性皮肌炎中阳性率较高，与皮肤溃疡的发生相关。结论抗PUF60抗体在中国肌炎患者中普遍存在，且不同亚型的临床相关性各异，提示抗PUF60抗体或其靶抗原PUF60可能在不同亚型的肌炎中参与了不同的致病过程。

特发性炎性肌病；抗PUF60抗体；剪接体

特发性炎性肌病 （idiopathic inflammatory myopathies，IIM）是一组以骨骼肌炎性浸润伴全身多脏器受累的难治性异质性自身免疫病，多发性肌炎（polymyositis，PM）和皮肌炎（dermatomyositis，DM）是IIM常见的临床亚型[1]。IIM的自身抗体包括肌炎特异性自身抗体 （myositis specific autoantibodies，MSAs）和肌炎相关性自身抗体（myositis associated autoantibodies，MAAs）， 见于70%～80%的成人IIM患者和60%幼年性皮肌炎（juvenile dermatomyositis，JDM） 患儿[2]。 PUF60（poly-U-binding factor 60 kDa）蛋白由559个氨基酸残基组成，是剪接体中U2snRNP的剪接因子，可通过诱导自身抗原表位扩展进而激发免疫反应[3]。Livia等人研究发现，在干燥综合征及高加索DM患者中均可检测到抗PUF60抗体，22例亚裔DM患者均抗PUF60抗体阴性[4]。为进一步明确抗PUF60抗体是否在中国IIM患者中表达，本研究检测了该抗体在我国IIM患者中的表达情况，并分析总结了其临床相关性。

图1A 肌炎患者中抗PUF60抗体的分布特点

图1B 4例IIM患者及HC的免疫印迹结果

1 资料与方法

1.1 临床资料

（1）肌炎组：选择1989年～2016年于我院住院治疗的IIM患者388例，包括DM 275例、PM 77例、肌炎重叠综合征36例。PM/DM的诊断符合1975年的Bohan/Peter标准，肌炎重叠综合征（myositis-overlap syndrome）的诊断则以“肌炎并发其他类型的结缔组织病”为依据[5]。在275例DM中，有41例为临床无肌病性皮肌炎（clinical amyopathicdermatomyositis，CADM）患者，其诊断依据：DM患者有特征性皮疹的临床表现而无肌肉受累的临床症状，血清肌酸激酶正常或轻度增高，肌电图、肌活检和影像学检查无或有轻度肌肉受累的证据，病程＞6 个月[6]。（2）健康对照组：我院门诊体检的健康者167名；男58名，女109名；年龄 19～45 岁，平均（38±7）岁；除外 RA、SLE、SS 等自身免疫疾病。所有血清采集分离后冻存于-80℃直至检测时使用。本研究通过我院伦理委员会批准（批准文号 2013-6）。

1.2 ELISA法检测血清中抗PUF60抗体

（1）包被：将商品化的重组 PUF60蛋白（美国，Origene，TP323492） 用 0.05M pH9.6 的碳酸盐包被缓冲液稀释至0.5滋g/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 100滋l，4℃过夜 （18～24h）。 （2）封闭：次日，PBS洗板，每孔加入200滋l含2%牛血清白蛋白（BSA）的洗涤缓冲液，37℃封闭 2h。 （3）加样：弃去孔内溶液并洗板，加1：200稀释的血清100滋l至上述已包被好的反应孔内，室温孵育60min。 （4）加酶标抗体：洗板，每孔加入 1：30000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗（美国，Abcam 公司）100滋l， 室温孵育 0.5 h。 （5） 显色：PBST洗板，各孔加入四甲基联苯胺底物反应液（中国，索莱宝公司）100滋l，室温孵育 5～10min 后加入 100滋l反应终止液（1mmol/L硫酸，中国，索莱宝公司）终止反应，在450nm处测吸光度A值。

1.3 免疫印迹法检测血清中抗PUF60抗体

（1）制样：用PBS将商品化PUF60蛋白5倍稀释，加入蛋白上样缓冲液后沸水浴5min。（2）制胶：配制10%分离胶及5%浓缩胶，依次注入玻璃板间隙，选合适孔梳，制备上样孔。（3）上样：将protein ladder（美国，Thermo公司）及处理过的蛋白上样后开始电泳，平均每孔蛋白量为0.5滋g。（4）转膜：采用半干转转膜仪，将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。（5）封闭：将NC膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭2h。（6）孵育一抗：用5%脱脂奶粉按1：50比例稀释患者血清，4℃过夜。（7）孵育二抗：TBST洗膜，用5%脱脂奶粉按1：2500比例稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗（美国，Abcam公司），室温反应 1h。（8）显色：用1：1混合的ECL化学发光底物A液和B液（美国，Pierce公司）将NC膜浸润，放入凝胶成像仪进行显色。

表1 抗PUF60抗体阳性的DM患者的临床特点

1.4 统计学方法

应用SPSS16.0软件进行统计学处理。非正态分布者用中位数及四分位数来描述。计量资料组间比较分别采用独立样本t检验、方差分析、非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验；计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确检验。

2 结果

2.1 抗PUF60抗体在DM、PM及肌炎重叠综合征患者中的阳性率

DM及肌炎重叠综合征患者的血清抗PUF60抗体水平均较对照组显著升高 （均P＜0.01）。以HCs的平均血清抗PUF60抗体水平加3倍标准差为阳性临界值 （0.249），计算抗体阳性率。抗PUF60抗体可见于11.3%（31/275）的DM患者，7.9%（6/76）的 PM 患者，21.6%（8/37）的肌炎重叠综合征患者，均显著高于 HCs（P＜0.01，P＜0.05），见图1A。有趣的是，DM组中CADM患者的抗PUF60抗体水平显著高于经典DM患者 （P＜0.01），其抗体阳性率（9/41，22%）也显著高于经典DM 患者（22/240，9.2%，P＜0.05）。 另外，我们对 4例DM患者血清中的抗PUF60抗体水平进行了免疫印迹实验验证（见图1B），发现其与ELISA结果之间均具有较好的一致性。

2.2 抗PUF60抗体与DM的临床相关性

表1示，经典DM患者中抗PUF60抗体阳性与技工手、抗PL-7抗体阳性及CD5+CD19+B细胞百分比升高相关，且与肌炎抗体阴性相关。CADM患者中抗PUF60抗体阳性者与发病年龄大、皮肤溃疡、心脏受累、血沉及Th/Ts水平升高相关。我们进一步分析了经典DM患者中肌炎抗体阴性组的临床特点，其抗PUF60抗体可见于17.6%（9/51）的患者，与皮肤溃疡及CD5+CD19+B细胞水平升高均相关（均P＜0.05）。

2.3 DM患者抗PUF60抗体水平与疾病活动度的相关性

由2位风湿免疫科主治医师对31例抗PUF60抗体阳性的DM患者进行肌炎活动度视觉模拟评分 （myositis activity of visual analogue scale，MYOACT），未发现抗 PUF60抗体水平与CK水平及MYOACT评分存在相关性（P＞0.05）。

我们对12例DM患者（8例抗PUF60抗体阳性和4例阴性）随访12～27个月（中位时间12个月）。患者泼尼松用量为5mg/d～38mg/d。随访中10例 （83.3%）对激素和/或免疫抑制剂治疗反应良好，血清CK及LDH水平恢复正常，且MYOACT评分显著改善，2例（16.7%）治疗反应性差（1例抗PUF60抗体阳性，1例阴性）。差值分析未发现8例抗体阳性的DM患者中抗PUF60抗体水平与CK及MYOACT评分存在相关性（P＞0.05）。

3 讨论

本研究首次探讨了我国IIM患者血清抗PUF60抗体的水平及临床意义，发现抗PUF60抗体可见于我国DM、PM及肌炎重叠综合征患者，且在CADM及肌炎重叠综合征患者中的高阳性率提示了其与IIM特殊临床亚型的相关性。抗PUF60抗体与经典DM中技工手、抗PL-7抗体阳性及CD5+CD19+B细胞百分比升高相关；与CADM中发病年龄大、皮肤溃疡、心脏受累、血沉升高和Th/Ts水平升高相关。以上研究结果证明，抗PUF60抗体在肌炎患者中普遍存在，且在不同肌炎亚型中的临床相关性各异。

我们的初步研究结果与Livia等的研究并不完全一致。其研究发现，抗PUF60抗体见于30%（25/84）SS患者，与抗-Ro52抗体、类风湿因子及高球蛋白血症相关；还见于21%的高加索DM患者（48/213），与抗 TIFγ 抗体相关[4]。 我们研究发现，抗PUF60抗体不仅见于中国DM患者，也见于PM及肌炎重叠综合征患者，此外，我们并未证实DM患者中抗PUF60抗体与抗TIFγ抗体的相关性。有趣的是，有研究发现抗FIR（PUF60的剪接变异体）抗体可见于早期结肠癌患者[7]，FIR在多种恶性肿瘤中也可见高表达[8]。还有研究证明PUF60能够抑制转录因子FBP（FUSE结合蛋白）进而抑制人肿瘤相关基因c-myc的表达[9]。因此，在DM合并肿瘤的特殊亚群中，应当进一步开展有关PUF60及其剪接变异体（FIR）和针对该靶抗原的特异性抗体的研究，从而明确该特殊亚群中肿瘤发生的病理机制。

PUF60还能够与YRNAs（小胞浆非编码RNA）相互作用进而参与自身免疫疾病的发生[10]。大部分YRNAs是Ro核糖体蛋白（RNPs）的重要组成部分[4]，而RNPs又与自身免疫疾病中免疫系统紊乱的发生密切相关[11]。自身抗原Ro/SSA和La/SSB同样参与组成Ro RNPs[12]，在SS患者中还发现抗PUF60抗体与抗Ro-52抗体相关[4]。在中国SLE患者中同样可检测到抗PUF60抗体（阳性率 17.3%）， 且与抗 dsDNA、Sm、SSB抗体相关[13]。而抗PUF60抗体在肌炎重叠综合征中的高阳性率不仅暗示其与混合结缔组织病的相关性，也提示了PUF60蛋白在自身免疫中的重要作用。此外，我们发现经典DM中抗PUF60抗体与抗PL-7抗体及技工手的发生相关，而后两者均提示肌炎抗合成酶抗体综合征的发生[14]。因此，为进一步探索IIM中抗PUF60抗体与抗合成酶抗体的相关性，需要后续进一步扩大样本细化研究。

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The prevalence and clinicalsignificance of anti-PUF60 antibody in patients with idiopathic inflammatory myopathy

ZHANG Ya-mei，PENG Qing-lin，WANG Guo-chun
Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Oct，31（5）：274-278

Objective：To detect the existence and to analyze the clinical significance of anti-PUF60 antibody in Chinese patients with idiopathic inflammatory myopathy（IIM）.MethodsThis study involved 388 IIM patients[including 275 patients with dermatomyositis （DM），76 with polymyositis （PM）and 37 with myositis overlap syndrome]and 167 healthy controls（HCs）.An ELISA was developed to detect serum anti-PUF60 antibody and immunoblotting analyses were performed to validate the ELISA results.ResultsAnti-PUF60 antibody presented in 11.3%DM patients，7.9%PM patients and 21.6%patients with myositis overlap syndrome，and the antibody positive rates of them were significantly higher than HCs （P＜0.05，P＜0.01）.Classical DM patients with anti-PUF60 antibody had lower prevalence of currently known myositis antibodies（P＜0.05）and higher prevalence of mechanic’shands.Whiletheprevalenceofanti-PUF60 antibodywasparticularlyhigherin theCADM subgroup （29% ）and associated with the incidence of skin ulcer.ConclusionAnti-PUF60 antibody can be detected in Chinese patients with IIM，and it is associated with distinct clinical features in different rheumatic diseases.This finding indicates that anti-PUF60 antibody is associated with different pathogenesis processes in different IIM subgroups.

idiopathic inflammatory myopathies；anti-PUF60 autoantibody；splicesome

Author’s addressPeking University China-Japan Friendship School of Clinical Medicine，Beijing 100029，China

R593.26

A

1001-0025（2017）05-0274-05

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.05.003

国家自然科学基金（91542121，81571603），首都卫生发展科研专项项目（2016-2-4063）。

1* 本文通迅作者。

张亚妹（1992-），女，硕士研究生。

2017-05-20

2017-06-22