不同致病力松材线虫的繁殖能力和移动能力比较1)

朱丽华 林丽 蒋鹏 王立超 徐武 叶建仁

(南京林业大学，南京，210037) (南方现代林业协同创新中心(南京林业大学))

不同致病力松材线虫的繁殖能力和移动能力比较1)

朱丽华 林丽 蒋鹏 王立超 徐武 叶建仁

(南京林业大学，南京，210037) (南方现代林业协同创新中心(南京林业大学))

通过黑松和马尾松接种明确不同松材线虫虫株的致病力，进而对不同致病力虫株的繁殖力、移动能力等生物学特性进行了比较。研究结果表明，虫株AMA3C28和USA的致病力显著强于C14-5和OKD-1，AMA3C28和USA接种35 d后，黑松枯萎率均达100%，而马尾松枯萎率分别为75%和20%；C14-5和OKD-1对黑松和马尾松无致病作用或有极弱的致病作用。接种35 d后，AMA3C28和USA在黑松苗内的增殖能力显著强于C14-5和OKD-1。在灰葡萄孢培养条件下，AMA3C28和USA的繁殖力、雌雄性别比例显著高于OKD-1；强致病力虫株AMA3C28和USA雌成虫尾部均为指状钝圆，而弱致病力虫株OKD-1和C14-5雌成虫中分别28%和2%尾部具有尾尖突。AMA3C28和USA在黑松茎段内迁移能力显著强于C14-5和OKD-1。因此，松材线虫在树体内的繁殖力及移动能力可能与其致病力有关。

松材线虫；松树；致病力；繁殖力；移动能力

松材线虫病是松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一种毁灭性森林病害[1]。1905年，松材线虫病首次于日本发现，20世纪80年代，该病害传入中国和韩国，随后传入葡萄牙和西班牙，逐渐成为最具危险性的全球性病害之一[2]。松材线虫病自1982年传入我国后不断扩散蔓延，现已扩散至江苏、安徽、浙江、云南、陕西、辽宁等17个省市[国家林业公告(2017年第4号)]，导致了严重的生态破坏和巨大的经济损失[3]。松材线虫病涉及松材线虫、传播媒介、寄主松树等多个因素相互作用，迄今，其致病机理尚未十分明晰。病原物的致病力是影响病害流行的关键因子之一。在过去几十年中，许多松材线虫虫株被收集，不同松材线虫虫株间致病力分化明显[4-5]，有些虫株致病力甚至丧失，被归为“无毒”虫株。松材线虫虫株间的致病力差异可能与寄主、地理来源或环境因素有关[4-5]，也可能与其伴生细菌种类有关[6]，或与其分泌的纤维素酶活力[7]，或与其繁殖力有关[8-9]，但也有研究认为，松材线虫的致病力与其繁殖力无关[10]，甚至呈负相关[11]。本研究首先对不同松材线虫虫株的致病力进行测定，在明确不同虫株致病力的基础上，对不同致病力虫株的生物学特性，包括雌成虫形态特征、性别比例、繁殖力、移动能力等进行了比较，旨在更全面地认识松材线虫致病力分化的原因，为进一步阐明松材线虫致病机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫株和松苗

来自松材线虫原产地以及两个松材线虫病严重发生国的4株松材线虫虫株被用于比较研究，其中，AMA3C28为来自中国强致病力虫株AMA3的近交系后代(近交20代)，OKD-1和C14-5为由日本引进的弱致病力虫株，USA虫株分离自松材线虫原产地美国的木质包装箱，其致病力未知。所有虫株来源详见表1。所有虫株使用前培养于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上，于冰箱4 ℃保存。

表1 供试松材线虫及拟松材线虫虫株来源

致病力测定用松苗为3年生盆栽黑松(Pinusthunbergii)和马尾松(P.massoniana)，使用前培养于南京林业大学森林保护系温室。

1.2 松材线虫的培养

将实验室保存的上述虫株在超净台下接入灰葡萄孢培养基上，封口后放入恒温箱中25 ℃培养。5～7 d后，待灰葡萄孢快要吃尽时，用贝尔曼漏斗法分离线虫。

1.3 松材线虫致病力测定

取上述4株松材线虫，采用皮接法对3年生黑松和3年生马尾松盆栽苗进行接种，每虫株接种松苗6～26株，接种线虫数量为4 500条/株，以无菌水接种为对照。接种后的幼苗放置于28 ℃，光照18 h的温室中培养，隔日浇水。观察松苗的发病情况，记录萎蔫症状出现的最早时间(针叶出现失水褪绿症状开始记录)和各虫株致萎蔫松苗数量，计算枯萎率((萎蔫数量/接种数量)×100%)。接种35 d后，采用贝尔曼漏斗法对黑松体内线虫进行再分离，24 h后，收集橡胶管底部液体，显微镜下统计线虫数量。

1.4 松材线虫在灰葡萄孢上的繁殖力及性别比例测定

在超净台中，将上述虫株接入长满灰葡萄孢的PDA培养基中，25 ℃恒温箱中培养。1周后，采用贝尔曼漏斗分离法分离线虫。24 h后，将松材线虫收集于无菌离心管中，3 500 r/min，离心3 min，弃上清液，无菌重悬，显微镜下计数线虫的数量，调节浓度至5 000条/mL。用移液枪取20 μL线虫悬浮液(约100条线虫)接种于新鲜灰葡萄孢上，25 ℃恒温箱中培养，每虫株4皿，重复3次。1周后分离灰葡萄孢上的松材线虫，在显微镜下统计线虫数量和性别比例，并观察雌成虫尾部形态。

1.5 松材线虫的移动能力测定

取3年生黑松当年生枝条，切成5 cm长茎段，用挑针在每个茎段顶部挖一小孔，每个孔的深度保持一致，立即用于试验。将松枝下端插到盛有4 mL无菌水的15 mL锥形离心管中(离心管上部事先已剪去，保留约4 cm高度)，将20 μL混合龄的松材线虫(约2 000条)悬浮液接种于茎段顶部小孔中。将接种过的茎段置于带盖的大塑料盒中，于培养箱中25 ℃保湿培养。分别于接种2、4、6、8、10、24、48、72 h后从离心管底部取水样，显微镜下统计线虫数量。每虫株接种3根茎段，重复3次。

1.6 数据分析

采用GraphPadPrism分析软件对各项数据进行统计分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同松材线虫虫株对黑松和马尾松的致病力

将松材线虫虫株AMA3C28、USA、C14-5和OKD-1接种于3年生盆栽黑松苗，结果表明，不同松材线虫虫株对黑松的致病力不同。松材线虫AMA3C28和USA接种的黑松苗于接种后第12天首先观察到萎蔫症状，并且发病松苗数量逐日增加，35 d后发病率达100%；虫株OKD-1和C14-5接种35 d后针叶与对照一样依然保持健康嫩绿，无任何植株出现萎蔫症状，发病率为0(表2)。

表2 黑松苗和马尾松苗接种不同松材线虫虫株后的结果

虫株编号马尾松接种数量/株最早出现萎蔫症状时间/d42d后枯萎率/%AMA3C28161575．0USA103520．0C14-526383．8OKD-124—0CK(无菌水)10—0

注：“—”表示没有观察到。

4个虫株接种3年生盆栽马尾松的试验结果显示，不同松材线虫虫株对马尾松的致病力差异较大。AMA3C28和USA接种的马尾松苗分别于接种后第15天和第35天首先观察到萎蔫症状，42 d后发病率分别为75%和20%；C14-5接种的26株松苗中，有1株发病，发病率为3.8%，而OKD-1接种的松苗均无任何植株表现萎蔫症状(表2)。

2.2 不同松材线虫虫株在黑松体内的繁殖力

接种35 d后，对黑松体内线虫进行再分离。结果显示，虫株AMA3C28和USA均在黑松体内大量繁殖，线虫数量平均分别达16 024条和41 173条；而OKD-1和C14-5未能在黑松体内建立种群，仅分离到极其少量的线虫(表3)。

表3接种35 d后不同松材线虫虫株在黑松苗体内的繁殖数量

虫株编号分离数量/株再分离线虫数量/条AMA3C28316024±5780USA341173±20480C14-5311±17OKD-130±1CK——

注：表中数据为平均值±标准差；—表示没有分离。

2.3 不同致病力松材线虫虫株在黑松茎段内的移动能力

将不同致病力松材线虫接种黑松茎段，结果表明，不同致病力虫株在黑松茎段内的移动能力不同。强致病力虫株AMA3C28和USA在接种后2 h分别有5和2条线虫通过黑松茎段，72 h后累计通过黑松茎段的线虫数量分别为203和98条；而弱致病力虫株C14-5和OKD-1在接种6 h后分别有1和3条线虫穿过黑松茎段，72 h后累计通过茎段的线虫分别为29和20条。因此，可以看出强致病力线虫AMA3C28和USA在黑松体内移动的能力明显强于弱致病力虫株C14-5和OKD-1。

2.4 不同致病力松材线虫虫株雌成虫尾部形态

通过对不同致病力松材线虫虫株雌成虫尾部的观察，发现强致病力虫株AMA3C28和USA雌成虫尾部均为指状钝圆。弱致病力虫株OKD-1和C14-5大部分雌成虫尾部形态为指状钝圆形，小部分雌成虫尾部具有2～3 μm的尾尖突。统计结果表明，OKD-1中具尾尖突的雌成虫数量占28.8%，C14-5中具尾尖突的雌成虫数量占2.16%。

2.5 不同致病力松材线虫虫株在灰葡萄孢上的繁殖力和性别比例

取AMA3C28、USA、OKD-1和C14-5混龄线虫接种在灰葡萄孢上，100条每皿，1周后分离线虫，显微镜观察并统计线虫数量。结果表明，强致病力虫株AMA3C28和USA在灰葡萄孢上的繁殖力大于弱致病力虫株OKD-1，差异显著(P<0.05)；AMA3C28和USA的繁殖力高于C14-5，但差异不显著；两株弱致病力虫株OKD-1和C14-5繁殖量差异不显著。繁殖1周后，虫株AMA3C28平均线虫量为(20 781±4 541)条，USA为(21 450±4 687)，C14-5为(12 428+1 883)条，OKD-1为(5 411±1 182)条。

对上述于灰葡萄孢上繁殖1周后的松材线虫虫株的雌雄成虫比例进行统计，结果表明，2株强致病力虫株AMA3C28和USA的雌雄比例显著大于2株弱致病力虫株OKD-1和C14-5，差异显著(P<0.05)。2株强致病力虫株雌雄成虫比例大于1，其中，AMA3C28和USA雌雄比例分别为(1.29±0.25)和(1.27±0.24)；2株弱致病力虫株雌雄比例小于1，其中C14-5为(0.86±0.10)，OKD-1为(0.84±0.16)；而2株强致病力虫株之间雌雄比例差异不显著，2株弱致病力虫株之间差异亦不显著(表4)。

表4不同致病力松材线虫虫株在灰葡萄孢上的繁殖力和性别比例

虫株编号繁殖力/条性别比例AMA3C28(20781±4541)a(1．29±0．25)aUSA(21450±4687)a(1．27±0．24)aC14-5(12428±1883)ab(0．86±0．10)bOKD-1(5411±1182)b(0．84±0．16)b

注：表中数据为平均值±标准差；同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

本研究比较了4株松材线虫的致病力，并探讨了不同致病力松材线虫虫株之间生物学特性的差异。通过对不对寄主松树的接种试验表明，试验选取的4株松材线虫致病力分化明显。其中，AMA3C28和USA对黑松的致萎蔫率均达100%，而OKD-1和C14-5均未能导致黑松萎蔫。对马尾松的接种试验显示，AMA3C28的致病力强于USA，C14-5致病力稍强于OKD-1。通过对两种寄主的致病力测定，4株松材线虫致病力从强到弱分别为AMA3C28、USA、C14-5、OKD-1。该试验结果与Aikawa等[8]以及Mota等[12]的结果相似。Aikawa等的接种结果显示，C14-5和OKD-1的致病力显著低于其他测试虫株，其中C14-5对黑松的致病力为5%，而OKD-1未能使黑松发病。Mota等[12]亦报道，C14-5对黑松的致病力明显弱于葡萄牙虫株。

关于松材线虫繁殖力和移动能力与其致病力的关系，目前尚未十分明晰。有研究认为松材线虫的繁殖力是影响松树萎蔫病发生发展的关键因子，松材线虫通常在侵染后10 d内在松树体内大量繁殖，最终导致松树死亡[13]，因此，较强的繁殖能力对其致病力有很大贡献。Kiyohara和Bolla[4]的研究显示，强致病力虫株在灰葡萄孢上培养6 d后，其繁殖量是弱致病力虫株的4倍。Wang et al.[14]发现强致病力虫株的代时短于弱致病力虫株，强致病力虫株的种群增长速率快于弱致病力虫株。朱丽华等[15]通过不同致病力虫株杂交后代的致病力测定亦发现，松材线虫致病力与其在松树体内的繁殖力存在正相关性。Mota et al.[12]的研究亦表明，弱致病力虫株在树体内的繁殖力显著低于强致病力虫株(平均仅6条/g干质量)。Aikawa和Kikuchi[8]认为，松材线虫的致病力可以通过其在灰葡萄孢上或松树枝段中的繁殖力进行初步判断，松树枝段可能比灰葡萄孢更适合于作为致病力评价的材料，因为线虫取食活的松树组织细胞并在松树组织中建立种群的能力是确定其毒力水平的重要因素。但也有研究认为，松材线虫的致病力与其繁殖力无关[10]，而Eo et al.[11]发现，松材线虫的繁殖力与其致病力呈负相关。本研究中，强致病力虫株在黑松苗内增殖的线虫平均数量显著高于弱致病力虫株。在灰葡萄孢上，强致病力虫株产生的后代数量也比弱致病力虫株更多，雌雄比例显著大于弱致病力虫株雌雄性别比例。

本研究中，与弱致病力虫株相比，强致病力虫株以更快的速度和更大的种群数量通过松树茎段。Odani et al.[16]的研究表明，松材线虫和拟松材线虫的迁移扩散能力与线虫毒力强弱之间有正相关性，Ichihara et al.[13]亦报道，强致病力虫株较弱致病力虫株在木质部树脂道和皮层组织中的扩散速度更快。但是，Togashi et al.[17]和Eo et al.[11]的研究结果与此相反，认为线虫的致病力与其迁移能力无相关性。马海宾等[18]认为，评价松材线虫迁移运动能力与松材线虫致病力的关系，应该综合考虑松材线虫分泌的致病性相关酶、群体迁移数量、繁殖力以及种源地等一系列因素。松材线虫在树体内移动的能力与其致病力可能存在一定关系。

已有研究表明，松材线虫可分为圆尾型(R型)和尖尾型(M型)。R型松材线虫雌成虫一般尾部末端钝圆，无尾尖突，并且该类群中大部分个体无尾尖突。M型松材线虫的雌成虫均具有明显的尾尖突，且该尾尖突经灰葡萄孢人工培养也不消失。有关松材线虫形态分化与致病性分化之间相互关系方面的研究未见报道。本研究观察结果显示，在灰葡萄孢培养条件下下，2株强致病力虫株雌成虫的尾部均为指状钝圆，而2株弱致病力虫株中，小部分雌成虫尾部具有尾尖突。

综上所述，松材线虫不同虫株致病力不同，不同致病力虫株在繁殖力、移动能力等方面差异较大，引起上述差异的本质原因有待进一步深入研究。

致谢：感谢日本京都大学Yuko Takeuchi副教授友情赠送弱致病力松材线虫虫株。

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ComparisononFecundityandMigrationAbilityofBursaphelenchusxylophiluswithDifferentVirulence

Zhu Lihua, Lin Li, Jiang Peng, Wang Lichao

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China); Xu Wu, Ye Jianren(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University)Journal of Northeast Forestry University，2017,45(12)：76-79.

Bursaphelenchusxylophilus；Pinusthunbergii； Virulence； Proliferation； Migration

1)江苏省高校自然科学研究重大项目(15KJA220003)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。

朱丽华，女，1970年10月生，南京林业大学林学院，副教授。E-mail:lhzhu@njfu.edu.cn。

叶建仁，南方现代林业协同创新中心(南京林业大学)，教授。E-mail:jrye@njfu.edu.cn。

2017年7月20日。

潘 华。

S763

The virulence of different strains ofBursaphelenchusxylophiluswas determined by challenging withPinusthunbergiiandP.massoniana. The strains with different virulence were screened and their biological characteristics were compared. Strains AMA3C28 and USA were more virulent than C14-5 and OKD-1. The wilting ratio onP.thunbergiiwas 100% for 35 d after inoculation with AMA3C28 and USA, while onP.massonianawere 75% and 20%, respectively. C14-5 and OKD-1 had no or very weak pathogenicity on bothP.thunbergiiandP.massoniana. AMA3C28 and USA proliferated rapidly inP.thunbergiiseedlings 35 d after inoculation, which was significantly higher than that of C14-5 and OKD-1. The fecundity of AMA3C28 and USA was significantly higher than that of OKD-1 and C14-5 when feeding onB.cinerea. The sex ratio of male and female in AMA3C28 and USA was significantly higher than that in C14-5 and OKD-1. Difference was also observed in tail morphology of adult female between virulent and avirulent strains when feeding on Botrytis cinerea. For strong virulent strains (AMA3C28 and USA), 100% adult females had no terminal mucro. However, about 28% of adult females of OKD-1 had terminal mucro and 2% of adult females of C14-5 had terminal mucro. The migration ability of AMA3C28 and USA in the stem segment ofP.thunbergiiwas higher than that of C14-5 and OKD-1.