一株高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及应用

韩昱姝，李永转，胡凤山*，梁丽娟

（山西三盟实业发展有限公司，山西 太原 030032）

一株高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及应用

韩昱姝，李永转，胡凤山*，梁丽娟

（山西三盟实业发展有限公司，山西 太原 030032）

γ-氨基丁酸是存在于人体中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，具有镇静神经、抗焦虑等功效。以泡菜为原料，利用指示剂变色法和γ-氨基丁酸含量检测筛选出7株产γ-氨基丁酸产酸菌，并从中筛选出一株稳定性较高菌株，经生理生化鉴定和16SrDNA序列分析为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），编号LF-fb-017。以牛奶为发酵底物，在温度37℃，L-谷氨酸钠浓度为0.5 g/100 mL条件下发酵3 d，终γ-氨基丁酸产量可达1.68 mg/mL。

γ-氨基丁酸；短乳杆菌；分离鉴定；牛奶

随着生活节奏加快，工作压力加大，疲劳已成为当今人们关注的热点问题之一。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）广泛存在于动植物体内（植物如豆属、藻类、蕨类、藓类等的种子、组织液和根茎中；动物则几乎只存在于神经组织中，浓度最高的区Ⅱ为大脑中黑质，脑组织中含量大约为0.1～0.6 mg/g组织）[1-3]。γ-氨基丁酸具有许多重要的生理功能（如降压、镇静、增强记忆、抗焦虑等），尤其对更年期的失眠、压抑和自身失调疗效良好。我国卫生部于2009年9月正式批准γ-氨基丁酸为新资源食品。随着γ-氨基丁酸生理功能的不断研究和阐明，目前已经发展成为一种新型的功能因子，正逐渐应用于医药、食品等行业[4-7]。

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，有帮助消化、有助于人体肠道的健康等功能，是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌[8]。短乳杆菌是乳酸菌中一种，目前已有多篇报道短乳杆菌能够高产γ-氨基丁酸[9-13]。因此，利用乳酸菌生产的GABA能达到食品安全级，并可进一步丰富乳酸菌作为益生菌的保健功效，应用前景广阔[14]。

牛奶是最天然的饮料之一，营养丰富，含有丰富的矿物质和必需氨基酸，牛奶中所含的钙质与L-色氨酸能产生诱发睡眠的荷尔蒙5-羟色胺与褪黑激素，有效助眠，与γ-氨基丁酸的功效相得益彰[15]。本试验选用牛奶、谷物等绿色健康食品作为乳酸菌的发酵底物，开发一种纯天然发酵的γ-氨基丁酸饮品，以期为γ-氨基丁酸在食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

韩国泡菜、酸白菜：市售；盐白菜：实验室自制。

MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，吐温-80 1.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水补至1.0 L，pH6.8。

菌种筛选培养基：在MRS固体培养基中添加0.1%溴甲酚绿。

发酵培养基：①MRS液体培养基（对照）；②牛奶培养基；③脱脂奶粉培养基；④酸奶培养基；⑤马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基⑥；高粱培养基：3%粉碎高粱；⑦大米培养基：3%大米粉；⑧3%粉碎高粱+3%豌豆；⑨3%粉碎高粱+3%黄豆。

L-谷氨酸钠（食品级），γ-氨基丁酸标准品、甲醇、乙腈（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；氨基酸衍生试剂（邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethylchloroformate，FMOC））：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S型分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PHS-3C型数显酸度计：上海仪电科学股份有限公司；DH-500A型电热恒温培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司；UV5100型分光光度计：上海元析仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高产γ-氨基丁酸菌种筛选

检测3种泡菜汁中γ-氨基丁酸含量，选择含量较高的泡菜汁，从中筛选高γ-氨基丁酸乳酸菌菌株。取泡菜汁2 mL，于无菌的MRS液体培养基中，恒温培养箱37℃静置培养48 h，富集菌种。将富集后菌种发酵液用无菌生理盐水稀释至10-12，吸取1 mL至无菌平皿中，倾注法倒平板，37℃倒置培养48 h。

1.3.2 高产γ-氨基丁酸菌种的分离纯化

从平板上的杂菌中挑选使溴甲酚绿变黄的菌株，在MRS固体平板上划线培养，直至培养出菌落形态单一的纯菌种为止。

1.3.3 高产γ-氨基丁酸菌种鉴定

将菌株37℃培养48 h后收集菌体，送北京中国食品发酵工业研究院微生物检测中心进行菌种鉴定，包括生理生化鉴定，DNA序列分析，并应用MEGA5.0软件与相关种的16S rDNA序列进行多次重复比对计算。

1.3.4 高产γ-氨基丁酸菌种培养基选择

以2%的接种量接入1.1部分的培养基筛选出的高产γ-氨基丁酸菌种，37℃静置培养48 h后，检测发酵液中γ-氨基丁酸含量。

1.3.5 发酵条件优化单因素试验

以γ-氨基丁酸产量为衡量指标，设置发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、γ-氨基丁酸底物质量浓度（L-谷氨酸钠）（0.1 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.5 g/100 mL、0.7 g/100 mL、1.0 g/100 mL）的单因素试验，考察发酵时间、γ-氨基丁酸底物质量浓度对饮品中γ-氨基丁酸产量的影响。

1.3.6 测定方法

将发酵液样品充分混匀后，取适量于离心杯中，5000r/min离心10min，取上清液。将上清液经过0.22 μm微孔滤膜过滤。色谱条件为：色谱柱为ZorbaxEclipse-AAA氨基酸分析柱；流动相A为40mmol/L NaH2PO4，调节pH为7.8；流动相B为甲醇、乙腈和水，混合比例为45∶45∶10；流速为2 mL/min；进样量为0.5 μL；柱温为40℃；检测波长为338 nm。

2 结果与分析

2.1 菌种初筛

表1 泡菜样品中γ-氨基丁酸含量Table 1 γ-aminobutyric acid contents in pickle samples

由表1可知，韩国泡菜中γ-氨基丁酸含量最高，为0.728 mg/mL。因此从韩国泡菜中筛选高产γ-氨基丁酸菌株。

利用含有溴甲酚绿指示剂的MRS固体培养基共筛得变色圈较大的产酸菌株31株，在MRS液态培养基中分别对其进行单菌种培养，检测发酵液中γ-氨基丁酸含量，结果见表2。

表2 产γ-氨基丁酸菌株初筛结果Table 2 Preliminary screening results of strains producing γ-aminobutyric acid

由表2可知，可得到7株产γ-氨基丁酸菌株，其中仅1株为革兰氏阴性菌，剩余6株均为革兰氏阳性，且菌落形态与镜检形态都较为相似，仅γ-氨基丁酸含量有差异。

2.2 菌种鉴定

对上述筛得的6株革兰氏阳性菌株经3～5次继代培养后，选择其中一株稳定性较好且γ-氨基丁酸含量较高的菌株H-3，分离纯化后，收集菌体，进行菌落形态鉴定及镜检测定，结果如图1所示。生理生化分析结果和16S rDNA基因序列分析结果如表3所示。与相关种的16S rDNA构建系统发育树如图2所示。

图 1菌株LF-fb-017菌落（A）及细胞（B）形态Fig．1 Colony （A）and cell（B）morphology of strain LF-fb-017

由图1可知，该菌株菌落呈乳白色，圆形，表面光滑，湿润，凸起，半透明，边缘整齐；菌体呈杆状，大小为（0.4～0.5）μm×（0.8～2.1）μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。

表3 菌种LF-fb-017生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LF-fb-017

图2 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

由表3、图2可知，该菌种与安全等级为1级的模式短乳杆菌ATCC 14869相似度100%，将该菌种鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），编号LF-fb-017。

2.3 发酵培养基的筛选

将LF-fb-017菌种种子液按照2%的添加量分别加入液体发酵培养基①～⑨中，于37℃恒温培养箱中静置培养3 d后，检测发酵液中γ-氨基丁酸含量，结果见表4。

表4 不同发酵培养基对γ-氨基丁酸含量的影响Table 4 Effects of different fermentation media on γ-aminobutyric acid content

由表4可知，该乳酸菌在MRS培养基、牛奶培养基和脱脂奶粉培养基中发酵培养可产生较高γ-氨基丁酸（分别为2.119 mg/mL、0.765 mg/mL、0.903 mg/mL），在牛奶与脱脂奶粉培养基中γ-氨基丁酸含量低于MRS培养基，猜测可能是由于该培养基中缺乏碳源导致，因此向上述两种培养基中补加碳源。谷物培养基中几乎不产生γ-氨基丁酸，可能是由于复配谷物中仍缺乏乳酸菌产γ-氨基丁酸所必需营养因子，还有待继续研究[16]。

牛奶培养基中葡萄糖添加量对γ-氨基丁酸含量的影响如图3所示，脱脂奶粉培养基中葡糖糖添加量对γ-氨基丁酸含量的影响如图4所示。

图3 牛奶培养基中葡萄糖添加量对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.3 Effect of glucose addition in milk medium on γ-aminobutyric acid content

图4 脱脂奶粉培养基中葡糖糖添加量对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.4 Effect of glucose addition in the skimmed milk powder medium on γ-aminobutyric acid content

由图3、图4可知，葡萄糖添加量为1%时，两种发酵液中γ-氨基丁酸含量基本达到最大值，之后随着葡萄糖添加量增加，γ-氨基丁酸含量趋于平缓或增加缓慢，因此可确定上述两种培养基中最适葡萄糖添加量为1%。对比图3、图4可发现，添加葡萄糖后牛奶培养基中γ-氨基丁酸含量增幅较大，最大值达到1.682 mg/mL，高于脱脂奶粉培养基中的最大值（1.372 mg/mL），因此选择含有1%葡萄糖的牛奶培养基为最适培养基。

2.4 发酵条件优化

该菌种的发酵过程共4个影响因素：发酵温度、发酵时间、γ-氨基丁酸底物质量浓度、发酵液pH值。其中发酵温度由菌株LF-fb-017的最适温度决定，为37℃；为确保牛奶的营养价值以及成分不被破坏，pH为牛奶固有pH值，不做改变。

2.4.1 不同发酵时间对γ-氨基丁酸含量的影响

图5 不同发酵时间对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.5 Effects of different fermentation times on γ-aminobutyric acid content

由图5可知，不同发酵时间对γ-氨基丁酸含量的影响较大，前2dγ-氨基丁酸含量激增，在第2天即可达到1.2mg/mL以上，但第3天增长缓慢，达到最大值1.653mg/mL，第4天开始下降，这可能是由于γ-氨基丁酸在第4天时消耗量大于产生量，导致含量下降。因此，选择3d为最佳发酵时间。

2.4.2 不同L-谷氨酸钠含量对γ-氨基丁酸含量的影响

图6 不同L-谷氨酸钠含量对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.6 Effects of different L-glutamate concentrations on γ-aminobutyric acid content

由图6可知，不同L-谷氨酸钠含量对γ-氨基丁酸含量有一定的影响，当L-谷氨酸钠含量较低时，γ-氨基丁酸含量随L-谷氨酸钠含量的增加而增加；当L-谷氨酸钠含量达到一定值（0.5 g/100 mL）时，γ-氨基丁酸含量变化较小，这可能是由于发酵液中其他因素限制了短乳杆菌对L-谷氨酸钠的转化。因此，选择0.5 g/100 mL为最适底物质量浓度。

3 结论

本研究以泡菜为原料，筛选出7株产γ-氨基丁酸菌株，并从中筛选出一株稳定性较高菌株，经鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），编号LF-fb-017。 该菌株在MRS液体培养基中可产生γ-氨基丁酸2.119 mg/mL，以牛奶为发酵底物，在温度37℃，γ-氨基丁酸底物浓度为0.5 g/100 mL的条件下发酵3 d，γ-氨基丁酸终产量可达1.682 mg/mL。

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Screening and application of lactic acid bacteria with a high yield γ-aminobutyric acid

HAN Yushu,LI Yongzhuan,HU Fengshan*,LIANG Lijuan
（Shanxi Three-League Industrial Development Co.,Ltd.,Taiyuan 030032,China）

γ-aminobutyric acid is an important inhibitory neurotransmitter in the central nervous system of human,with the effects of nerves sedative,anxiolytic and so on.In this study,7 γ-aminobutyric acid-producing strains were screened from pickle by using indicator color change method and detection of γ-aminobutyric acid content.A strain with high stability was screened out and identified by physiological biochemical tests and 16S rDNA sequencing asLactobacillus brevisLF-fb-017.Using milk as fermentation substrate,the γ-aminobutyric production was 1.68 mg/ml at the conditions of temperature 37℃,L-glutamate 0.5 g/100 ml and fermentation time 3 d.

γ-aminobutyric acid;Lactobacillus brevis;isolation and identification;milk

TS201.3

0254-5071（2017）12-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.015

2017-10-09

山西三盟实业发展有限公司专项基金（2016）

韩昱姝（1989-），女，助理工程师，硕士，研究方向为食品微生物发酵工程。

*通讯作者：胡凤山（1965-），男，高级工程师，硕士，研究方向为食品微生物发酵工程。