内蒙古传统酸奶乳酸菌的筛选及体外益生效果评价

韩墨，王燕，杨志鹏，张志伟，王婷

（齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省微生物重点实验室，山东济南250353）

内蒙古传统酸奶乳酸菌的筛选及体外益生效果评价

韩墨，王燕，杨志鹏，张志伟，王婷*

（齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省微生物重点实验室，山东济南250353）

对内蒙古传统酸奶中分离出的8株乳酸菌菌株进行形态学及16S rDNA鉴定，确定其中包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜热链球菌。然后进一步对菌株的酸、胆盐、人工胃肠液耐受性、胆固醇降解能力及自由基清除能力进行体外益生效果评价。结果表明，鼠李糖乳杆菌217-3对pH=1.5的强酸和人工胃肠液有较高的耐受性，同时还能耐受1.5%的胆盐。此外，其胆固醇降解和自由基清除能力也具有较高的水平。综上所述，鼠李糖乳杆菌217-3具有显著的益生性能，为高活性乳酸菌菌剂及相关发酵产品的开发奠定了一定的理论基础。

乳酸菌；抗逆性；降胆固醇；抗氧化

目前世界上常用于益生菌的菌株大多为乳酸菌，如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和双歧乳杆菌等一些菌株。但并不是这些菌株的每一株菌都可以作为益生菌，只有经过科学验证的菌株才可以作为益生菌。同时，并不是每一株益生菌都是全面手，能够发挥所有的健康功效[1]。近年来，乳酸菌产业迅猛发展，平均年增长幅度达到了20%左右。因此，建立具有自主知识产权的乳酸菌菌种资源库，并在此基础上筛选和开发适合我国乳品行业和乳酸菌制剂行业发展的益生乳酸菌菌种、发酵剂和益生菌制剂显得尤为必要。

内蒙古是我国主要牧区之一，牧民将采集的鲜奶通过自然发酵做成酸奶、奶酪等乳制品，具有提高营养、延长鲜奶保质期等优点。这些传统的发酵乳制品含有丰富的乳酸菌资源，菌株经过长期的自然进化，发酵出的传统乳制品有着独特的结构和风味，并具有良好的益生保健功能[2]。因此，充分挖掘和高效利用这些宝贵的菌种资源成为目前益生乳酸菌研发的重要方向。本研究主要通过对内蒙古传统酸奶中乳酸菌菌株的模拟人工胃液耐受性、胆盐耐受性、体外降胆固醇及抗氧化活性进行测定，着力于筛选出具有潜在益生特性的优良菌株，为今后开发新型功能性益生菌制品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

牛胆盐、胆固醇、胃蛋白酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：生工生物工程有限公司；邻苯二甲醛：天津精细化工研究所；氢氧化钾、正己烷、冰醋酸、浓硫酸：天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

U-3900紫外-可见分光光度计：日本日立公司；BX53F正置荧光显微镜：日本奥林巴斯公司。

1.3 培养基与试剂

MRS液体培养基（g/L）：大豆蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐温 80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸钠5.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰 0.054 g，蒸馏水 1 000mL，1 mol/L 乙酸调pH值为6.5，121℃灭菌15min。

胆固醇溶液配法：将胆固醇0.06 g、牛胆盐0.12 g、蔗糖脂肪酸脂0.06 g、冰乙酸5mL、吐温0.6mL加于试管中，超声振荡至完全溶解[4]。

0.2mg/mL胆固醇培养基：在300mL灭菌后的MRS液体培养基中加入5.6mL现配的胆固醇溶液，12mL 6 mol/L NaOH溶液，振荡混匀。其中6 mol/L NaOH溶液灭菌处理，胆固醇溶液用0.2 μm的有机细菌过滤头过滤。

人工胃液：将胃蛋白酶过滤除菌，溶解在灭菌的0.5%NaCl溶液中，终浓度为3 g/L，并用浓盐酸调节pH值到2.0。

人工肠液：胰蛋白酶（1 g/L）和猪胆盐（1 g/L）溶解在灭菌的0.5%NaCl溶液中，并调节pH值到8.0[5]。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株的分离纯化

吸取100 μl内蒙古传统发酵乳样品于离心管中，加入到900 μL生理盐水中，充分振荡混匀后，稀释到10-4、10-5，取100 μL稀释液涂布于MRS琼脂平板上，置于37℃厌氧培养24 h～72 h，挑取典型单菌落，划线分离纯化。对分离所得的菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验。

1.4.2 菌株的16S rDNA分子鉴定

提取菌株的基因组DNA进行片段扩增：采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物，正向引物：A27F：5’-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTAC GA-3，反向引物：A1495R：3’-GCAGAGTTCTCGGA GTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5’，1.5%琼脂糖凝胶电泳，目标片段长度约1 500 bp。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物委托山东省农科院进行测序。

1.4.3 菌株对酸的耐受性

为了研究经过筛选鉴定的八株酸杆菌的酸胁迫抵抗能力，对酸胁迫下他们的存活率进行检测。将2%过夜培养的细菌转接到5mL新鲜MRS培养基中，37℃静止培养至OD600=1.0，离心收集菌体，弃掉培养基，将菌体悬浮在pH值为1.5、2.5的MRS培养基中，根据胃酸的酸度和食物在胃中的停留时间，将菌株培养基在37℃条件下继续培养4 h后，等比稀释，涂布MRS平板，活菌计数，每个试验重复3次，求其平均值，计算其存活率[6]。

式中：A1为0 h时的活菌数；A2为4 h时的活菌数。

1.4.4 菌株对胆盐的耐受性

将1%过夜培养的细菌转接到5mL新鲜MRS培养基中，37℃静止培养至OD600=1.0，离心收集菌体，弃掉培养基。将菌体悬浮在牛胆盐浓度为0.5%、1.0%、1.5%的MRS培养基中，37℃继续培养6 h后，等比稀释，涂布MRS平板，活菌计数，每个试验重复次，求其平均值[7-8]。

1.4.5 菌株对人工胃肠液的耐受性

将2%过夜培养的细菌转接到5mL新鲜的MRS培养基中，37℃静止培养至OD600=1.0，离心收集菌体，弃掉培养基，加入等体积的人工胃液或者人工肠液，37℃静止培养6 h后，等比稀释，涂布MRS平板，活菌计数，每个试验重复3次，求其平均值[9]。

1.4.6 菌株对胆固醇的降解作用试验

1.4.6.1 胆固醇标准曲线的绘制

将胆固醇工作液分别配制成不同浓度的胆固醇溶液（30、35、40、45、50、55μg/mL），测定吸光值（A550nm）并绘制胆固醇标准曲线。

1.4.6.2 胆固醇含量的测定

对邻苯二甲醛法进行改良。取样品4mL加到具塞试管中，加入33%KOH溶液3mL混匀，再加入95%乙醇3mL，盖塞漩涡振荡1.5min。60℃水浴15min，迅速冷却至室温。向原试管中加入正己烷3mL，混匀后加入蒸馏水2mL，混匀静置10min后，取2mL上层液体加至干净的玻璃试管中，于50℃恒温箱中挥发。待挥发完毕后向每个试管中分别加入2mL当天配制的邻苯二甲醛工作液，混匀后静置10min，再加入浓H2SO41mL，并迅速混匀，静置10min后测定550 nm下的吸光值[10-11]。

1.4.6.3 菌株胆固醇去除能力测定

供试菌株以2%接种于MRS-STC-CHOL培养基，37℃发酵24 h。分别测定培养上清液（12 000 r/min，10min，4℃）中胆固醇含量，计算胆固醇去除率。胆固醇去除率/%=（初始胆固醇含量-上清液胆固醇含量）/初始胆固醇含量×100[12]。

1.4.7 菌株清除DPPH自由基能力的测定

取不同浓度的8种菌液1mL（109、1010CFU/mL）加入2mL DPPH乙醇溶液（0.5 mmol/L），混合均匀后室温下避光反应30min，4℃、8 000 r/min离心10min，取上清液，于517 nm波长处测吸光度，无菌水空白调零。空白组以等体积乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积无菌水代替菌液。DPPH自由基清除率计算见公式[13]。

式中：A为空白组的吸光度；A0为对照组的吸光度；As为样品组的吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌株分离与鉴定

对内蒙古传统酸奶样品进行菌株分离，挑选在MRS平板上菌落形态为圆形、表面光滑、乳白色的小菌落，并结合革兰氏染色阳性，无芽孢、不产过氧化氢酶的实验结果，最后经16s rDNA检测，确定为其中3株为鼠李糖乳杆菌、2株植物乳杆菌、1株干酪乳杆菌、1株瑞士乳杆菌、1株嗜热链球菌。将其分别命名为217-1～217-8进行后续体外益生效果评价。

2.2 菌株对酸的耐受性评价

选取指数生长期的菌株进行酸胁迫耐受性试验，8株菌株在未进行酸胁迫处理时（0 h），它们的菌落活菌数为相同数量级。伴随酸胁迫处理时间的延长，不同菌株对酸胁迫耐受力产生差异，如图1所示。

图1 菌株在pH 1.5、2.5条件下的存活率变化情况Fig.1 The survival rate of the strain under pH 1.5，2.5 was changed

由图1可知，菌株217-1、217-3、217-4、217-5、217-7菌株具有良好的酸耐受性，其中菌株217-3的存活率最高，在pH1.5时为72%。在所有菌株中的抗酸胁迫能力是最强；而菌株217-2、217-6、217-8抗酸胁迫能力相对较差，在pH值为1.5、2.5时，存活率出现了较大程度的下降。以上实验证明不同的乳酸菌菌株的抗酸胁迫能力不同，且菌株的抗酸胁迫能力不具备一致性。尤其以217-3最适合在强酸性条件下生长。

2.3 菌株对胆盐的耐受性评价

以筛选出的酸耐受性好的5株菌株为出发菌株，参考消化道中胆盐的浓度（在进食消化的开始1 h，其质量浓度为15 g/L～20 g/L，之后其质量浓度降为3 g/L左右）[14]，对其胆盐耐受性检测，结果见表1。

表1 不同胆盐质量浓度下菌株的生长情况Table 1 Tolerance of the strains to different concentrations of bile salts

如表1所示，我们筛选出胆盐耐受性较好的菌株为 217-1、217-3、217-4、217-5。其中 217-3 对胆盐耐受力较强。在1.5%的胆盐浓度条件下，具有较好的耐受性且菌落数呈现了明显增长，根据现有文献报道，该菌株对胆盐的耐受性亦高于已报道鼠李糖乳杆菌胆盐耐受水平，具有较高的研究价值。

2.4 菌株对人工胃肠液的耐受性评价

以筛选得到的对酸、胆盐具有良好耐受性的4株菌株为出发菌株，用胃蛋白酶、胰蛋白酶、猪胆盐和浓盐酸模拟人工胃、肠液，对此4株菌的人工胃肠液耐受性进行比较。结果如图2、图3所示。

图2 菌株在pH2.0的人工胃液中活菌数变化情况Fig.2 Changes of viable count in the artificial gastric juice of pH2.0

图3 菌株在pH8.0的人工肠液中活菌数变化情况Fig.3 Changes of viable count in the artificial intestinal fluid of pH8.0 strain

由图2、图3可知，菌株217-1对人工胃、肠液耐受性较高，该菌株在pH=2.0的人工胃液中处理6 h，能保持6.3×108cfu/mL活菌数，在pH=8.0的人工肠液中处理6 h，能保持2.3×108cfu/mL活菌数，该活菌数的保持，为菌株在肠道内黏附和定植提供了良好的保障。

2.5 菌株株的体外降胆固醇能力

2.5.1 胆固醇标准曲线的制定

图4为胆固醇浓度标准曲线图。

图4 胆固醇标准曲线Fig.4 Cholesterol standard curve

回归方程为y=0.040 1x-0.878 5，R2=0.990 9。由试验结果可见，测定结果呈现良好的线性关系。

2.5.2 菌株胆固醇去除能力测定

恒定pH值条件下菌体MRS-STC-CHOL培养液胆固醇含量、降解情况见表2。

表2 恒定pH条件下菌体MRS-STC-CHOL培养液胆固醇含量、降解情况Table 2 Cholesterol content and degradation of MRS-stc-chol culture medium under constant pH conditions

由表2可知，菌株都具有降解胆固醇的能力，但是其能力大小因菌株的不同有所差异。其中217-1、217-5和217-8的体外降解胆固醇能力较强，胆固醇降解率63.4%、59.5%和47.6%。而其他的菌株的降解率出除了217-6以外都在30%以上。

2.6 菌株清除DPPH自由基能力检测

菌株对DPPH自由基的清除能力比较见图5。

图5 菌株对DPPH自由基的清除能力比较Fig.5 Comparison of the strains for scavenging effects on DPPH free radicals

由图5可知，不同菌株的DPPH自由基清除能力差异显著，且菌株的清除能力与浓度呈正比，随无细胞提取液浓度的增加，DPPH自由基的清除能力不断提高。在受试的8株乳酸菌中，217-1在1010CFU/mL时对自由基的清除能力最高，清除率为54.26%。此外，217-5也表现出较高的自由基清除能力，在1010CFU/mL时对自由基的清除率均在50%以上。

3 讨论

本研究从内蒙传统酸奶中分离出的乳酸菌菌株出发，经过革兰氏染色、过氧化氢酶及16S rDNA鉴定，确定了其乳酸菌的种类。然后进行体外耐酸、耐胆盐、耐人工胃肠液能力和将降解胆固醇能力的测定；筛选出1株具有高抗活性的乳酸菌。旨在了解不同属乳酸菌耐酸耐胆盐性及降解胆固醇能力，从而筛选出既具有耐酸耐胆盐又有良好降胆固醇能力的优良菌株217-1，为开发乳酸菌制剂奠定一定的理论基础。

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Screening of Lactic Acid Bacteria in Traditional Yoghurt of Inner Mongolia and Evaluation of Its Benefit in vitro

HAN Mo，WANG Yan，YANG Zhi-peng，ZHANG Zhi-wei，WANG Ting*
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbiology，Qilu University of Technology（Shandong Academy of Science），Jinan 250353，Shandong，China）

In Inner Mongolia traditional yogurt in eight strains of lactic acid bacteria strains were isolated from the morphological and 16S rDNA appraisal，determine including rhamnose lactobacillus，plant lactobacillus，lactobacillus casei and lactobacillus，Swiss hot streptococcus.Then further the evaluation of the probiotic effect of acid，bile salt，artificial gastroenteric fluid tolerance，cholesterol degradation ability and free radical removal ability were further evaluated.The results showed that lactobacillus lactobacillus was 217-3，which had high tolerance to the strong acid and artificial gastroenteric acid of 1.5，and was also able to withstand 1.5%of bile salts.In addition，the cholesterol degradation and free radical removal ability also had high levels.From what has been discussed above，rhamnose lactobacillus has significant live performance，217-3 for highly active lactic acid bacteria bacterium agent and related fermentation product development has laid a theoretical foundation.

lactic acid bacteria；stress resistance；cholesterol lowering；antioxidant

韩墨，王燕，杨志鹏，等.内蒙古传统酸奶乳酸菌的筛选及体外益生效果评价[J].食品研究与开发，2018，39（1）：152-156

HAN Mo，WANG Yan，YANG Zhipeng，et al.Screening of Lactic Acid Bacteria in Traditional Yoghurt of Inner Mongolia and Evaluation of Its Benefit in vitro[J].Food Research and Development，2018，39（1）：152-156

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.030

山东省自然科学基金（ZR2016CB14）；国家自然科学基金项目（31701576）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201610431013）

韩墨（1992—），男（汉），硕士研究生，研究方向：微生物资源开发。

*通信作者：王婷（1985—），女，博士。

2017-05-23