基于iTRAQ技术的中医实热“上火”血清蛋白质组学特征分析

陈 娟 徐 莉 谢冠群 周 佳 谢志军 甘 静 范永升

(浙江中医药大学基础医学院，杭州，310053)

基于iTRAQ技术的中医实热“上火”血清蛋白质组学特征分析

陈 娟 徐 莉 谢冠群 周 佳 谢志军 甘 静 范永升

(浙江中医药大学基础医学院，杭州，310053)

目的：筛选实热“上火”血清差异表达蛋白，为实热“上火”机制的深入研究提供科学依据。方法：采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)对血清蛋白质进行检测，结合生物信息学分析(GO、STRING)筛选实热“上火”与正常非“上火”人群差异显著的蛋白质。结果：与正常对照组比较，实热上火组血清筛选出49个差异蛋白质，其中上调的22个，下调的27个。载脂蛋白C3(Apo C3)、乳酸脱氢酶(LDH)和维生素K依赖蛋白S(PROS1)等显著上调，而载脂蛋白A4(Apo A4)、超氧化物歧化酶3(SOD3)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)等显著下调。结论：观察组脂质代谢、糖酵解异常与氧化应激、炎性反应的发生密切相关，且凝血功能下降，易造成出血，筛选的差异蛋白可为实热“上火”的生物学基础研究提供依据。

实热上火；iTRAQ；血清蛋白质组学；生物标志物

“上火”是对身体出现口疮、鼻衄、牙宣、目赤、咽痛、口干便秘等症状的统称，发生率较高，且与口腔溃疡、失眠症等多种常见病的发病密切相关[1]。《素问·阴阳应象大论》“壮火食气”“少火生气”，论述了火的不同作用；火为热之极、热为火之渐，火热同类，常连在一起。《素问·至真要大论》病机十九条，其中9条涉及“火、热”病机，强调了火热致病的重要性。现代医学对“上火”还没有统一认识，认为“上火”与机体免疫功能失调情况下出现的局部感染、应激状态下机体内环境失衡及能量代谢等相关，医学上也称之为应激性疾病[2-3]。随着社会的发展和亚健康观念的提出，人们的健康意识不断提高，现代医学对上火尚缺乏有效的治疗方法，而中医学分别采用清热泻火法、滋阴降火法等治疗，疗效较为明显，但是中医注重宏观观察，缺乏对“上火”科学内涵的认识。因此，运用现代的科学技术方法来研究“上火”发生机制，不仅能够丰富其科学内涵，同时对于防治“上火”和提高人们的健康水平也有着重要的现实意义。

生命活动的功能执行者是蛋白质，绝大多数生命调控过程、各种代谢过程、疾病的原发过程以及大多数药物作用靶标均发生在蛋白质水平。现阶段，血清蛋白质组学的研究越来越受到国内外的关注，血清中含有的蛋白质种类很多，只有不断进行筛选和鉴定，才能进一步帮助探明疾病的发生、监控疾病的进程和每个阶段相应蛋白表达水平的关联性及规律性[4]。相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术自开展以来，在疾病研究和药物监测方面应用广泛，其不但可以检测出更多的低丰度蛋白，甚至可以灵敏的检测到其他技术无法检测到的跨膜蛋白，具有高灵敏度、高分辨率、标记效率高、样品兼容性和重复性好等优点，在血清蛋白质组学的研究中被广泛应用[5-6]。

本研究以在校大学生为研究对象，基于iTRAQ技术对实热“上火”和健康人群血清中蛋白质进行检测，并结合生物信息学方法挖掘观察组与正常非“上火”人群的差异蛋白，寻找其物质基础和可能的分子标志物，为“上火”机理的深入研究提供依据，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年3月至2014年10月浙江中医药大学在校大学生43例，分为观察组(实热“上火”人群)和对照组(正常非“上火”人群)，其中观察组21例，对照组22例,其中的一般资料如图1[7]所示，年龄及性别比较，差异无统计学意义(P>0.05),具有统计学意义。促凝管采集血液样本，30 min内以3 000 r/min离心，分离血清后于-80 ℃保存。

图1 实热上火组与正常对照组的年龄和性别比较

注：control:正常对照组，SH：实热上火组，(a)实热上火组与正常对照组的年龄比较，(b)实热上火组与正常对照组的性别比较。与正常对照组比较，*P>0.05

1.2 诊断标准 采用专家咨询法，通过多轮的专家咨询，确定的“上火”的诊断标准：1个主症(头面部症状)或2个次症(至少1个为头面部症状)。其中“上火”头面部主症：牙龈肿痛、咽喉肿痛、口臭、口腔溃疡、鼻疮疖、热疮(颜面部疱疹)、口苦、目赤干涩；“上火”头面部次症：口角糜烂、目眵增多、舌痛、口渴、鼻衄、鼻腔干燥、齿衄、痤疮、声音嘶哑、头痛；非头面部症状：大便干结、心烦、小便黄、多食易饥、五心烦热、痔疮发作、潮热、失眠[7]。

1.3 纳入标准 实热“上火”的纳入标准为：1)1个主症+舌象或脉象，其中主证为：眼眵或痰或涕等分泌物增多、黄稠，发热或恶热、目赤、面红、牙龈肿痛、大便秘结；舌脉为舌红苔黄燥、脉数有力[7]。2)平和质健康人群(作为正常对照组)，符合《中医体质分类与判定》[8]中平和质的判定标准；3)年龄18～60周岁；4)自愿参加本实验研究并同意签署临床研究知情同意书者。

1.4 排除标准 1)不符合纳入标准者；2)合并精神病、肿瘤、自身免疫性疾病以及系统靶器官严重病变等疾病的患者；3)妊娠及哺乳期的妇女；4)研究中认为有任何不适宜入选的情况[7]。

1.5 试剂与仪器 iTRAQ试剂盒(Applied Biosystems，Foster city，CA，USA)，胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)。Agilent MARS-14柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，旋转真空浓缩器RVC 2-25，Christ，Osterode，Germany)，旋转真空浓缩器(RVC 2-25，Christ，Osterode，Germany)，聚乙烯基柱(2.1×100 mm，5 μm，200 μm;Nest Group，Inc.，Southborough，MA，USA)，ZORBAX 300SB-C18柱(5 μm，200Å，0.1×150 mm，Microm，Auburn，CA，USA)，Triple TOF 5600系统(Applied Biosystems)。

1.6 方法

1.6.1 酶解与iTRAQ标记 将每组样本的血清混合，根据iTRAQ试剂盒说明书对各组血清样品进行iTRAQ标记。为了富集低丰度蛋白，使用Agilent MARS-14柱去除14种高丰度蛋白，包括白蛋白，IgG和触珠蛋白等，然后蛋白质被浓缩和脱盐，通过Bradford方法定量蛋白质样品的洗脱液。将每组的蛋白质样品(100 μg)还原，烷基化，并用胰蛋白酶在37 ℃下消化过夜。正常对照组和实热上火组分别应用115和118试剂标记。

1.6.2 MS/MS鉴定与数据分析 iTRAQ试剂将2个样品组混合，脱盐和干燥。通过强阳离子交换(SCX)液相色谱法使用聚乙烯基柱将iTRAQ-标记的肽分段。总共收集10个SCX组分，浓缩并溶解。随后加载样品到ZORBAX 300SB-C18柱。组件进行SCX色谱法到MS分析2次。峰面积的比率的iTRAQ报告离子反映了相对丰富的肽和蛋白质。蛋白使用ProteinPilotTM软件(Applied Biosystems，Version 4.2)进行鉴定和定量，使用ProGroup算法识别肽，MS/MS数据通过人类国际蛋白指数数据库(HIPI，version 3.87)搜索[9-10]。统计分析以组间表达差异>1.5(上调)或<0.5(下调)，且以P<0.05为差异有统计学意义，筛选差异蛋白质。

图2 数据采集的实热“上火”血清蛋白生物标志物分析

注：(A)生物过程;(B)细胞成分;(C)分子功能;(D)COG功能分类;(E)通过String软件分析的蛋白质网络作用图

1.6.3 生物信息学分析 差异表达蛋白质的细胞组分，分子功能和生物学过程通过Gene Ontology(GO)数据库进行分析，相互作用网络通过STRING软件分析(http://string-db.org/)分析，相互作用可信度为0.9(可信度最大值为1)，并且将鉴定到的蛋白质和COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins蛋白相邻类的聚簇)数据库进行比对，预测这些蛋白质可能的功能并对其做功能分类统计。

2 结果

2.1 血清蛋白质组鉴定分析结果 使用iTRAQ-2D LC-MS/MS筛选对照组与实热“上火”组差异蛋白，实验重复2次，2次鉴定结果中共有蛋白质取2次鉴定的平均值，分别鉴定的以当次结果为准。使用R程序包TopGO，选取P<0.05的富集结果，使用string database进行分析，相互作用可信度为0.9。

2.2 观察组与对照组血清差异表达蛋白 进一步筛选到观察组与对照组间49个差异表达蛋白，包括22个表达上调蛋白(>2.0倍，P<0.05)(表1)和27个下调蛋白(<0.5倍，P<0.05)(表2)。见表1-2。GO富集分析差异化表达的蛋白质主要参与单一生物过程(10.17%)、刺激应答(9.18%)和生物调节(8.44%)(图2A)此外，蛋白质集中定位于细胞(15.42，15.42%)和细胞器(12.08%)(图2B)，多数具有结合(51.19%)、催化活性(17.86%)酶调节活性(11.90%)(图2C)。该COG功能分类图显示：蛋白质功能主要集中在次生代谢产物生物合成、转运、分解代谢(7个蛋白质)(图2D)。蛋白质相互作用网络图集中指向纤溶-凝血-补体系统，以及脂质代谢异常(图2E)。

2.3 血清差异蛋白筛选与鉴定 观察组与对照组存在显著差异的49个蛋白质中，经过筛选鉴定，发现和“上火”病证相关的主要差异蛋白有载脂蛋白(ApoC3、ApoA4)、补体蛋白(C4A，C4BPA)、炎性因子(SAA1、CRP)、凝血功能相关因子类(PROS1、A1AT、PAI-1)、糖酵解相关酶LDH及抗氧化蛋白酶SOD3等。

3 讨论

表1 实热“上火”与正常人群相比显著上调的差异蛋白质(22个)

表2 实热“上火”与正常人群相比显著下调的差异蛋白质(27个)

载脂蛋白是一类家族较庞大的蛋白，包括A、B、C、E族等，脂质必须和载脂蛋白结合才能正常转运，与脂质代谢的平衡息息相关。载脂蛋白(Apo)C3和A4基因，它们是ApoA1/C3/A4/A5基因簇的成员，在脂质代谢中起重要作用，其多态性变异可导致高脂血症，是心血管疾病的易感因素。ApoC3是有效抑制VLDL-TG水解作用的重要因子，浓度升高见于代谢综合征、动脉粥样硬化等，是形成心血管疾病的危险因子。ApoC3也能激活NF-κB和单核细胞，促进各种炎性反应和导致动脉粥样硬化。ApoA4参与乳糜微粒合成和分泌，并参与胆固醇逆向转运，是高密度脂蛋白(HDL)和乳糜微粒(CM)的主要成分，具有抗炎和抗动脉硬化的属性，是一种重要的“内源性”抗氧化剂[11]。C反应蛋白(CRP)是机体在理化因素、肿瘤、外伤、感染等刺激下由肝脏合成而产生的急性时相反应蛋白，可反映疾病严重程度和转归情况，感染或非感染性炎性反应时血清CRP明显升高，因此常常作为诊断感染的生物学指标[12]。综上所述，结果显示观察组CRP和ApoC3显著上调，ApoA4显著下调，说明观察组的脂质代谢异常，抗炎、抗氧化能力降低与炎性反应的发生密切相关。

超氧化物歧化酶(SOD)在机体中作为重要的防御体系，能消除新陈代谢过程中产生的有害物质，其有3种亚型：胞质内的SOD1、线粒体内SOD2及细胞外Cu/Zn-SOD(SOD3)[13]。Cu/Zn-SOD因其重要的生理功能和巨大的治疗潜能，被认为是超氧化物歧化酶家族最重要的一类酶。研究表明Cu/Zn-SOD具有抗血管生成和抗炎作用，可通过阻止免疫细胞浸润和抑制白细胞与血管内皮细胞黏着参与免疫应答，其不仅可作为一种抗氧化剂，而且还能作为信号传播的一个控制器，参与信号传导。目前通过基因敲除和转基因越来越多的研究结果揭示，SOD3与衰老、高血压、糖尿病、细胞凋亡与增生等相关[14-16]。本研究发现观察组SOD3表达显著降低，推测实热“上火”引起的炎性反应、抗氧化能力降低等症状与SOD3的变化密切相关。观察组多发生局部炎性反应，如口腔溃疡、牙龈炎等，本课题代谢组学结果发现，患者血中乳酸出现上调，推测炎性反应部位物质分解代谢加快，组织耗氧量增加，局部出现微循环障碍，影响氧供应，引发无氧糖酵解增强，释放的乳酸未能及时被清除，在血液中堆积[7]。乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶，广泛存在于机体各种组织中，其中以心肌、骨骼肌和肾脏含量最为丰富，当组织细胞受到炎性反应等损伤时会释放到细胞外，导致血中含量明显增加。本研究发现LDH表达显著升高，结合同批次人群代谢组学结果乳酸含量的升高，证实实热“上火”情况下糖酵解增强。

此外，研究观察组炎性反应及免疫相关差异蛋白均存在于凝血与补体级联反应信号通路，是内源性凝血激活途径和经典补体激活途径的重要调节蛋白。在细胞信号传导中蛋白并不是孤立存在的，众多的蛋白在同一条生化反应途径中执行各自的生理功能，不同的蛋白信号通路通过媒介又相互联系，在凝血与补体级联反应信号通路中，补体C4具有中和病毒的生物学活性，可水解为C4A、C4B，它们在补体活化、促进吞噬、防止免疫复合物沉着和中和病毒等方面发挥作用。补体C4BP是一种可溶性血浆糖蛋白，是补体激活经典途径中一个重要调节蛋白[17]。维生素K依赖蛋白S(PROS1)是参与补体活化过程调控的一种血浆蛋白质，PROS1能与C4BP结合，参与补体活化，补体的过度(异常)活化可以引起炎性反应及组织损伤。同时PROS1也是一种抗凝血因子，可以作为辅因子激活蛋白C，抑制血液凝固[18]。SERPINA1基因编码的蛋白α1-抗胰蛋白酶(A1AT)的升高能够抑制凝血酶活性，抑制血纤维蛋白凝血酶原的生成，从而抑制纤维蛋白凝块降解[17]。SERPINE1基因编码的蛋白纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)是纤溶酶原激活剂tPA和uPA的主要抑制剂，是纤溶系统的主要调节因子，PAI-1不仅在纤溶过程和在维持凝血和纤溶的动态平衡中有作用，在体内许多的生理过程中都有作用，例如能抑制蛋白的降解，如凝血、结缔组织演变、补体激活、炎性反应过度反应等[19-20]。PAI-1表达降低可引起纤溶(酶)活性异常增强，影响凝血功能，造成出血，说明观察组的凝血功能下降。

综上所述，观察组的症状可能通过纤溶-凝血-补体级联反应信号通路引起，该信号通路上的差异蛋白可作为“上火”生物学基础研究的潜在靶点。另外该信号通路间接激活炎性反应，载脂蛋白、SOD3的变化引起抗氧化能力降低可能是实热“上火”表征的另一路径或靶向治疗的关注点。

[1]马捷,宋月晗,梁嵘,等.“上火”科学内涵的文献研究[J].中医学报，2016,31(3):372-375.

[2]李思敏,包洁，梅丽君,等.论“上火”与饮食[J].黑龙江中医药,2015，44(2):6-7.

[3]唐晓阳,谢冠群,范永升.现代医学对上火的认识及其对中医治疗的启示[J].浙江临床医学,2013,15(3):389-390.

[4]Gianazza E,Miller I，Palazzolo L,et al.With or without you-Proteomics with or without major plasma/serum proteins[J].J Proteomics，2016(140):62-80.

[5]王秋红,王悦,杨欣,等.基于iTRAQ技术的血清蛋白质组学研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2017，1(1):5-7.

[6]Anderson NL，Matheson AD，Steiner S.Proteomics：applications in basic and applied biology[J].Curr Opin Biotechnol,2000,11(4):408-412.

[7]周佳,吴德鸿,韦双双,等.基于GC-MS对中医实热“上火”血清代谢特征的研究[J].中华中医药杂志,2017，32(4):1789-1792.

[8]中华中医药学会.中医体质分类与判定[M].北京:中国中医药出版社，2009.

[9]Wang YS，Cao R，Jin H，et al.Altered protein expression in serum from endometrial hyperplasia and carcinoma patients[J].J Hematol Oncol,2011,4(1)：15.

[10]Jin GZ,Li Y,Cong WM,et al.iTRAQ-2DLC-ESI-MS/MS based identification of a new set of immunohistochemical biomarkers for classification of dysplastic nodules and small hepatocellular carcinoma[J].J Proteome Res,2011,10(8)：3418-3428.

[11]Kang SH,Kim YR,Hong SH.Synergic effects of the ApoC3 and ApoA4 polymorphisms on the risk of hypertension[J].Genes & Genom，Genes & Genomics,2017(39)：1-10.

[12]Wu JJ，Rowan CG，Bebchuk JD，et al.Association between tumor necrosis factor inhibitor(TNFi)therapy and changes in C-reactive protein(CRP)，blood pressure，and alanine aminotransferase(ALT)among patients with psoriasis，psoriatic arthritis，orrheumatoid arthritis[J].J Am Acad Dermatol，2015,72(5)：917-919.

[13]Batinic-Haberle I，Tovmasyan A，Roberts ER，et al.SOD therapeutics：latest insights into their structure-activity relationships and impact on the cellular redox-based signaling pathways[J].Antioxid Redox Signal,2014，20(15):2372-2415.

[14]Jiang W，Tang L，Zeng J，et al.Adeno-associated virus mediated SOD gene therapy protects the retinal ganglion cells from chronic intraocular pressure elevation induced injury via attenuating oxidative stress and improving mitochondrial dysfunction in a rat model[J].Am J Transl Res，2016，8(2):799-810.

[15]Doddigarla Z,Parwez I,Ahmad J.Correlation of serum chromium，zinc，magnesium and SOD levels with HbA1c in type 2 diabetes：A cross sectional analysis[J].Diabetes Metab Syndr，2016,10(1 Suppl 1):S126-S129.

[16]Wei LF，Zhang HM，Wang SS，et al.Changes of MDA and SOD in brain tissue after secondary brain injury with seawater immersionin rats[J].Turk Neurosurg，2016，26(3)：384-388.

[17]张海燕,张淼,吕顺武,等.凝血与补体级联反应信号通路对艾滋病湿热内蕴证发病的影响[J].中国全科医学,2017,20(6):694-698.

[18]Rodriguez-Leal GA,Morn S,Corona-Cedillo R,et al.Portal vein thrombosis with protein C-S deficiency in a non-cirrhotic patient[J].World J Hepatol,2014,6(7):532-537.

[19]Agirbasli M,Eren M,Yasar S,et al.Functionally stable plasminogen activator inhibitor-1 in a family with cardiovascular disease and vitiligo[J].Journal of thrombosis and thrombolysis,2014,38(1):50-56.

[20]Sahebkar A,Simental-Mendia LE,Watts GF,et al.Impact of fibrate therapy on plasma plasminogen activator inhibitor-1：a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Atherosclerosis 2015，240(1):284-296.

AnalysisofSerumProteomicsFeaturesof“Shanghuo”inTraditionalChineseMedicineBasedoniTRAQTechnology

Chen Juan, Xu Li, Xie Guanqun, Zhou Jia, Xie Zhijun, Gan Jing, Fan Yongsheng

(CollegeofBasicMedicalSciences,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China)

Objective:To screen differentially expressed proteins in excessive heat “shanghuo” serum and provide a scientific basis for in-depth study on the mechanism of excessive heat “shanghuo”.MethodsSerum proteins were detected by relative and absolute quantitative isotope labeling (iTRAQ), and bioinformatics analysis (GO, STRING) was used to screen the proteins that were significantly different between the normal fever group and normal non-lit group subjects.ResultsCompared with the normal control group, 49 differentially expressed proteins were screened by excessive heat “Shanghuo” group, with 22 up-regulated and 27 down-regulated. Apolipoprotein C3 (Apo C3), lactate dehydrogenase (LDH), and vitamin K-dependent protein S (PROS1) were significantly up-regulated while Apo A4, SOD3 and the plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) and so on were significantly down-regulated.ConclusionThe abnormal lipid metabolism and glycolytic abnormality in the “shanghuo” crowd are closely related to the occurrence of oxidative stress and inflammation, and the coagulation function is decreased, leading to easily bleeding. The differential proteins screened can provide references for biological foundation of basic research on “shanghuo”.

Excessive heat; iTRAQ; Serum proteomics; Biomarker

R22;R24

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.008

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2014CB543001)；973计划子课题(2014CB543001-1)；浙江中医药大学基础医学院科技创新团队项目(JCIT2016-1)

陈娟(1984.09—)，女，博士，副教授，研究方向：中西医结合防治疑难病，E-mail：mytw_00@163.com

范永升(1955.11—)，男，博士，教授，国家重点学科带头人，研究方向：中医药防治风湿自身免疫病，E-mail:fyszjtcm@163.com

(2017-11-03收稿 责任编辑：张文婷)