氯霉素对斑马鱼幼鱼发育及免疫毒性的研究

王荣春，何秋霞，韩建，陈锡强，孙晨，王希敏，韩利文，刘可春

(山东省科学院生物研究所，山东省生物检测技术重点实验室，山东省科学院药物筛选技术重点实验室，山东 济南 250014)

氯霉素对斑马鱼幼鱼发育及免疫毒性的研究

王荣春，何秋霞，韩建，陈锡强，孙晨，王希敏，韩利文*，刘可春*

(山东省科学院生物研究所，山东省生物检测技术重点实验室，山东省科学院药物筛选技术重点实验室，山东 济南 250014)

以野生型及转基因Tg(lyz:EGFP)斑马鱼幼鱼为研究对象，研究氯霉素对斑马鱼幼鱼的发育毒性及对免疫细胞的影响。用不同浓度的氯霉素分别处理72 h，观察斑马鱼幼鱼的生存率、畸形率和形态变化，以及标记绿色荧光免疫细胞在斑马鱼幼鱼中的数量。结果显示，随着氯霉素浓度(≥ 100 mg/L)的升高和暴露时间的延长，斑马鱼的存活率和孵化率降低，死亡率升高；氯霉素对斑马鱼幼鱼的致畸作用，主要表现为心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲；通过对Tg(lyz:EGFP)品系的观察，发现氯霉素(≥ 75 mg/L)可以降低斑马鱼幼鱼免疫细胞的数量。研究表明，氯霉素对斑马鱼幼鱼的致畸和致死作用具有剂量、时间依赖性，并可以导致斑马鱼幼鱼的免疫细胞数量减少，具有免疫毒性。

氯霉素；斑马鱼；发育毒性；免疫细胞

氯霉素(chloramphenicol)是一种广谱抗生素，广泛应用在农业、畜牧业、水产养殖业及临床应用中。氯霉素能够抑制多种微生物的生长，但在其应用过程中也会对机体产生危害，如骨髓抑制、白血病、再生不良性贫血等[1-3]。欧盟、美国及日本等国家已经禁止在水产养殖和畜牧业中使用氯霉素，在我国虽然也已禁止，但由于其价格低廉且容易获得，在生产、生活中仍有大量应用。

斑马鱼是近年来药物筛选和安全评价普遍使用的新型模式生物，在基因水平上与人类具有87%的同源性，而且具有繁殖周期短、胚胎透明易于观察、遗传操作简单以及饲养简便等优点[4-5]。同时，荧光标记不同组织(肝脏、心脏、肾脏等)、细胞(神经细胞、免疫细胞等)的多种转基因斑马鱼品系的出现，也促进了斑马鱼在不同学科研究中的应用[6-8]。与传统的实验动物大、小鼠相比，斑马鱼具有实验操作简便、用药量少、培养时间短、经济等优点。斑马鱼作为一种体内实验的模式动物，现已广泛应用于分子发育生物学、遗传学、环境毒理学和免疫学等学科的研究中[9-10]。

本研究以斑马鱼幼鱼为动物模型，探讨了氯霉素对斑马鱼幼鱼的发育毒性，并研究了氯霉素对斑马鱼幼鱼中心粒细胞发育及迁移的影响，为抗生素的毒理学研究提供了参考依据。

1 实验材料和仪器

1.1 试剂

氯霉素(Sigma公司)使用DMSO(Sigma公司)配置，用斑马鱼养殖水溶解稀释。斑马鱼养殖水的配方为:5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4[11]。三卡因( Sigma 公司) 使用纯净水配成质量分数0.16%的溶液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物

1.3 仪器

体视荧光显微镜 SZX16(Olympus 公司)；斑马鱼饲养养殖系统(北京爱生科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 氯霉素与斑马鱼幼鱼共孵育

将受精后1 h的野生型斑马鱼AB品系放在培养皿中，在显微镜下挑选发育正常的胚胎于6孔板中，每孔30个胚胎。实验中氯霉素的浓度分别设置为0、25、50、75、100、150、200、300 mg /L(养殖水配置)和空白对照组(DMSO)，每孔给予不同浓度的氯霉素暴露液5 mL，每个浓度组分别设置 3个重复孔， 给药后放在 28 ℃ 恒温培养箱中继续控光培养。连续药液暴露 3 d，每24 h更换一半药液，并去除死亡幼鱼。

2.2 斑马鱼幼鱼观察和记录

分别在给药24、48、72 h后记录斑马鱼死亡数和畸形数，然后计算其死亡率、畸形率。使用三卡因麻醉幼鱼后，在体视荧光显微镜下拍照观察，并记录斑马鱼形态变化。

2.3 免疫细胞观察

将受精后1 h的转基因斑马鱼Tg(lyz:EGFP)品系进行氯霉素处理(0、25、50、75、100、150 mg/L)，方法同2.1。

给药72 h后，使用三卡因麻醉幼鱼，在体视荧光显微镜下拍照观察绿色荧光标记的中性粒细胞的数量和定位。

2.4 数据统计

采用数据统计软件SPSS 16.0对实验数据进行统计学分析，所有数据用平均值±标准差表示，并进行样本均数间多重比较。

3 结果与分析

3.1 氯霉素对斑马鱼幼鱼死亡率的影响

观察斑马鱼幼鱼的死亡情况，氯霉素暴露24 h后，空白对照组和氯霉素组(≤ 200 mg/L)在斑马鱼存活率上没有统计学差异，300 mg /L组斑马鱼存活率显著下降；氯霉素暴露48 h后，随着浓度的提高，氯霉素组(≥ 150 mg/L)存活率显著性降低(P<0.05)；给药72 h后，氯霉素组(≥ 100 mg/L)幼鱼存活率显著降低，300 mg/L处理组斑马鱼幼鱼存活率低于5 %，见图1。

*表示P<0.05,与对照相比具有显著差异。图1 氯霉素暴露对斑马鱼幼鱼存活率的影响Fig.1 The effect of chloramphenicol exposure on the survival rate of juvenile zebrafish

3.2 氯霉素对斑马鱼幼鱼孵化率和发育畸形的影响

氯霉素暴露72 h后，100、150、200、300 mg /L组斑马鱼孵化率显著降低(P <0.05)，其中300 mg/L组孵化率接近0 %，见图2。100、150、200、300 mg /L组斑马鱼畸形率显著提高(P <0.05)，其中200、300 mg /L组畸形率为95%以上。畸形主要表现为心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲等症状，见图3、4。

*表示P<0.05,与对照相比具有显著差异。图2 氯霉素暴露72 h对斑马鱼胚胎孵化率的影响Fig.2 The effect of chloramphenicol exposure for 72 h on the hatching rate of zebrafish embryos

YSE 卵黄囊水肿； PE 心包水肿； SC 脊柱弯曲； CTL 对照。 图3 氯霉素对斑马鱼幼鱼发育的影响Fig.3 The impact of chloramphenicol on the morphological development of the juvenile zebrafish

*表示P<0.05,与对照相比具有显著差异。图4 氯霉素暴露72 h对斑马鱼畸形率的影响Fig.4 The impact of chloramphenicol exposure for 72 h on the malformation rate of zebrafish

3.3 氯霉素对斑马鱼幼鱼中性粒细胞发育的影响

选取不同浓度的氯霉素(0、25、50、75、100、150 mg/L)处理绿色荧光标记中性粒细胞的转基因斑马鱼Tg(lyz:EGFP)品系胚胎。暴露72 h后，在体式荧光倒置显微镜下观察，发现氯霉素可以抑制中性粒细胞的荧光表达，随着氯霉素浓度升高，斑马鱼免疫细胞数目明显减少。对斑马鱼尾部免疫细胞的数目进行计数并统计，发现与对照组相比，氯霉素暴露组(75、100 mg/L)斑马鱼幼鱼尾部中性粒细胞的数目显著降低，见图5，6。

图5 氯霉素对斑马鱼免疫细胞发育的影响Fig.5 The effect of chloramphenicol on the immune cells development of juvenile zebrafish

*表示P<0.05,与对照相比具有显著差异。图6 AE氯霉素处理对斑马鱼免疫细胞数目的影响Fig.6 The effect of chloramphenicol treatment on the immune cell number of zebrafish

4 讨论

氯霉素从20世纪中叶被发现以来，在一段时期内，作为人及动物临床治疗疾病的药物及饲料添加剂广泛应用于畜牧业及水产养殖业，主要用于清除对机体造成不利影响的各类病菌。然而，氯霉素在使用过程中表现出多种毒副作用，临床表现出严重的骨髓造血机能抑制、灰婴综合征、神经毒性及免疫毒性等[12-14]。尽管抗生素的使用会导致病菌产生抗药性并对有机体产生危害，但是在一些缺乏对此类药物进行管理控制的国家，仍然被大量使用。

斑马鱼胚胎及其幼鱼用于研究药物的发育毒性具有独特优势[15-16]，多种荧光标记的转基因斑马鱼，可以在透明的鱼体中直接观察药物对各类组织及细胞的作用，更加有利于其在药物评价中的应用[17-18]。

本实验通过不同浓度氯霉素暴露(25、50、75、100、150、200、300 mg /L)野生型AB品系斑马鱼，结果表明，氯霉素暴露24 h后，空白对照组和氯霉素组(≤ 200 mg/L)在斑马鱼存活率上没有统计学差异(P>0.05)，300 mg /L组斑马鱼存活率显著下降；氯霉素暴露48 h后，随着浓度的提高，氯霉素组(≥ 150 mg/L)存活率显著性降低(P>0.05)；给药72 h后，氯霉素组(≥ 100 mg/L)幼鱼存活率显著降低，300 mg/L处理组斑马鱼幼鱼存活率低于5 %。说明氯霉素对斑马鱼的发育具有毒性，并呈现剂量和时间依赖性。根据上述结果，我们选用25、50、75、100、150 mg /L的氯霉素处理免疫细胞标记荧光的转基因斑马鱼Tg(lyz:EGFP)品系，结果发现暴露72 h后75、100 mg/L组斑马鱼免疫细胞数目明显减少，而低浓度25、50 mg/L组，斑马鱼免疫细胞数目也明显减少，说明氯霉素对斑马鱼幼鱼具有免疫毒性。

本研究以斑马鱼幼鱼为动物模型，探讨了氯霉素对斑马鱼幼鱼的发育毒性，并利用转基因斑马鱼在体直接观察了氯霉素对免疫细胞的毒性影响，为进一步阐述抗生素免疫毒性提供了重要模型。

[1]ROBBANA-BARNAT S，DECLOITRE F，FRAYSSINET C，et al. Use of human lymphoblastoid cells to detect the toxic effect of chloramphenicol and metabolites possibly involved in aplastic anemia in man [J]. Drug Chem Toxicol，1997，20(3)：239-253.

[2]王自良，赵坤，张改平. 氯霉素的毒性及其在动物性食品中的残留与检测 [J]. 河南科技学院学报(自然科学版)，2005，33(2)：101-105.

[3] del MAR CENDRA M, CHRISTODOULIDES M, HOSSAIN P，et al. Effect of different antibiotic chemotherapies on Pseudomonas aeruginosa infection in vitro of primary human corneal fibroblast cells[J].Front Microbiol，2017， 8：1614.

[4] RENSHAW S A，TREDE N S. A model 450 million years in the making：zebrafish and vertebrate immunity [J]. Dis Model Mech，2012，5(1)：38-47.

[5] RODRIGUEZ-NUNEZ I，WCISELl D J， LITMAN G W，et al. Multigene families of immunoglobulin Domain-containing innate immune receptors in zebrafish：deciphering the differences [J]. Dev Comp Immunol，2014，46(1)：24-34.

[6]STARNES T W，HUTTENLOCHER A. Neutrophil Reverse Migration Becomes Transparent with Zebrafish [J]. Adv Hematol，2012，2012：398640.

[7]何秋霞，董贞兰，楚杰，等．芦荟大黄素对斑马鱼胚胎发育及运动行为学的毒性研究[J]．山东科学，2015，28(3)：23-28.

[8]TURANI M，BANFALVI G，PETER A，et al. Antibiotics delay in vitro human stem cell regrowth [J]. Toxicol In Vitro，2015，29(2)：370-379.

[9]刘可春，孙晨，王希敏，等．斑马鱼模型在药物早期安全性评价中的应用 [J]. 山东科学，2014，27(5)：1-8.

[10] SUAREZ C R，OW E P. Chloramphenicol toxicity associated with severe cardiac dysfunction [J]. Pediatr Cardiol， 1992，13(1)：48-51.

[11]张云，吴媛，陈维云，等． 异烟肼对斑马鱼胚胎发育量-毒关系的研究 [J]．山东科学，2015，28( 5) : 14-21.

[12]FAN H B，LIU Y J，WANG L，et al. miR-142-3p acts as an essential modulator of neutrophil development in zebrafish [J]. Blood，2014，124(8)：1320-1330.

[13]刘曦薇，吴玲玲．氯霉素对斑马鱼早期发育的毒性效应 [J]．环境科学学报，2010，30(8)：1649-1657.

[14]ZHANG W，SUN W F，AN S，et al. Acute and chronic toxic effects of chloramphenicol on Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa [J]．Water Environ Res，2013，85(8)：725-732.

[15]VOELZ K，GRATACAP R L，WHEELER R T. A zebrafish larval model reveals early tissue-specific innate immune response to Mucor circinelloides [J]．Dis Model Mech，2015，8(11)：1375-88.

[16]谢英，张力，刘树锋. 斑马鱼免疫学研究进展 [J].实验动物科学，2013，30(3)：50-53.

[17]张勇，贺剑辉，刘洪翠，等. 斑马鱼在药物临床前毒理学研究中的应用进展及现状 [J]. 中国药理学与毒理学杂志，2013，27(3)：482-483.

[18]LIESCHKE G J，CURRIE P D．Animal models of human disease: Zebrafish swim into view [J]．Nature Reviews Genetics，2007，8(5)：353-367．

Researchontheeffectsofchloramphenicolondevelopmentalandimmunetoxicityofjuvenilezebrafish

WANGRong-chun，HEQiu-xia，HANJian，CHENXi-qiang，SUNChen，WANGXi-min，HANLi-wen*，LIUKe-chun*

(ShandongProvincialEngineeringLaboratoryforBiologicalTestingTechnology,KeyLaboratoryforDrugScreeningTechnologyofShandongAcademyofSciences,BiologyInstitute，ShandongAcademyofSciences,Jinan250301,China)

∶The impact of chloramphenicol on developmental toxicity and immune cells of wild and transgenic Tg(lyz:EGFP) juvenile zebrafish was investigated. After treated separately with different concentrations of chloramphenicol for 72 hours, the survival rate, abnormal rate, morphology variation of juvenile zebrafish, and the number of immune cells labeled with green fluorescent in juvenile zebrafish were observed. The results showed that with the increase of the concentration of chloramphenicol (≥100 mg/L) and the exposure time, the survival rate and hatching rate of zebrafish decreased, and mortality increased. The teratogenic effects of chloramphenicol on juvenile zebrafish included yolk sac edema, pericardial edema and spinal curvature. Through observation of the transgenic strain Tg(lyz:EGFP), it was found that chloramphenicol (≥75 mg/L) could inhibit the number of immune cells in zebrafish. This study showed that chloramphenicol had teratogenic and lethal effects on juvenile zebrafish in a time dependent and dose dependent manner. And chloramphenicol had immune toxicity, which could reduce the number of immune cells in juvenile zebrafish.

∶chloramphenicol；zebrafish；developmental toxicity；immune cell

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.006

2017-09-14

山东省科学院青年基金(2015QN010，2015QN012)；山东省自然科学基金三院联合基金(ZR2015YL009，ZR2015YL013)

王荣春(1983—)，男，博士，研究方向为药理学。E-mail:1wangrongchun@163.com

*通信作者，韩利文(1980—)，男，博士，研究方向为药物筛选及代谢组学研究。E-mail: hanliwen08@126.com 刘可春(1964—)，男，博士，研究方向为药物筛选。E-mail:hliukch@sdas.org

R737.33

A

1002-4026(2017)06-0035-06