姜黄素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖及凋亡的影响*

李文全，曹忠胜△，钱 伟

(1.苏州大学附属第二医院耳鼻喉科，江苏苏州 215000；2.镇江第一人民医院耳鼻喉科，江苏镇江 212002)

论著·基础研究

姜黄素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖及凋亡的影响*

李文全1，曹忠胜1△，钱 伟2

(1.苏州大学附属第二医院耳鼻喉科，江苏苏州 215000；2.镇江第一人民医院耳鼻喉科，江苏镇江 212002)

目的探讨姜黄素对人鼻咽癌(NPC)CNE-2细胞增殖及凋亡的影响。方法不同浓度(0、10、20、40、60 μmol/L)姜黄素处理NPC细胞株CNE-2，利用噻唑蓝(MTT)实验检测CNE-2细胞增殖活性，利用流式细胞仪检测CNE-2细胞周期及凋亡率，利用Hoechest33258荧光染色法观察细胞凋亡情况。结果姜黄素可明显抑制CNE-2细胞增殖作用，且随姜黄素浓度增加，CNE-2细胞抑制率呈上升趋势(P<0.05)，姜黄素作用CNE-2细胞24、48、72 h的半抑制浓度(IC50)分别为(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L，即姜黄素可明显抑制CNE-2细胞增殖作用，且呈现明显浓度、时间依赖性；流式细胞检测结果显示，0、10、20、40、60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞，凋亡率随着姜黄素浓度增加而上升；荧光染色结果可见，CNE-2细胞未给予姜黄素处理，细胞呈圆形或者椭圆形，细胞核大小均匀一致，染色质分布均匀的淡蓝色荧光；10 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞胞体缩小，细胞核染色质凝聚，呈颗粒状亮蓝色荧光；20 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞出现胞体缩小，细胞核浓缩、染色质不均匀，出现凋亡小体，甚至出现核碎裂；40和60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞凋亡小体数量增多，出现大量核碎裂。结论姜黄素对NPC细胞株CNE-2细胞增殖具有明显抑制作用，且促进CNE-2细胞凋亡。

姜黄素；鼻咽肿瘤；CNE-2细胞；细胞增殖；凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国最为常见的恶性肿瘤之一，在我国南方地区发病率较高[1-2]。NPC由于组织结构特殊，生长位置较深，常不易发现，且手术切除困难，临床上主要以高剂量放化疗为主要治疗手段[3]。但是放化疗在起到一定治疗效果的同时，也给患者带来了巨大的痛苦及不良反应，长时间放化疗还可导致耐药性的产生，因此，开发新的高效低毒治疗药物仍是目前治疗NPC的关键。姜黄素因具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[4]，是目前抗肿瘤药物研究的热点。大量研究表明，姜黄素对胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤具有明显的抑制作用[5]。本研究旨在探讨姜黄素对NPC细胞株CNE-2细胞增殖及凋亡的影响，为姜黄素治疗NPC的可行性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 NPC细胞株CNE-2细胞，购自中国科学院肿瘤细胞库。

1.1.2主要仪器与试剂 姜黄素、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)试剂盒(美国Sigma公司)，新生小牛血清、RPM11640培养基(杭州四季青生物公司)，细胞周期及凋亡检测试剂盒(碧云天生物研究所)，Hoechest33258荧光染料(美国Biotium公司)；二氧化碳(CO2)培养箱(美国Thermo Fisher公司)，FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理 将NPC细胞株CNE-2细胞接种于RPM11640培养基中(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，5% CO2培养箱37 ℃恒温培养，每24～48小时更换培养液，经过3次传代稳定后，取对数生长期细胞进行实验研究。配制0、10、20、40、60 μmol/L的姜黄素分别作用于CNE-2细胞24、48、72 h。

1.2.2MTT实验 利用MTT实验检测不同浓度姜黄素处理后对CNE-2细胞增殖的影响，具体操作严格按照试剂盒使用说明书进行。细胞增殖抑制率=(1-处理组吸光度值/对照组吸光值)×100%，半抑制浓度(IC50)为细胞增殖抑制率达50%时的药物浓度。

1.2.3流式细胞仪检测CNE-2细胞周期及凋亡率 利用FACSCalibur流式细胞仪检测CNE-2细胞周期及凋亡率情况，具体操作严格按照仪器及试剂盒使用说明进行。

1.2.4Hoechest33258荧光染色 利用Hoechest33258/碘化丙锭(PI)荧光染色法观察细胞凋亡情况，倒置荧光显微镜下观察CNE-2细胞的形态。以弥散均匀蓝色荧光者为CNE-2活细胞，细胞质或细胞核出现致密浓染颗粒状荧光者为凋亡细胞，计算CNE-2细胞凋亡率。

2 结 果

2.1姜黄素对CNE-2细胞增殖作用的影响 10、20、40、60 μmol/L姜黄素可明显抑制CNE-2细胞增殖作用，且随姜黄素浓度增加，CNE-2细胞抑制率呈上升趋势(P<0.05)；姜黄素作用CNE-2细胞24、48、72 h的IC50分别为(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L，见表1、图1。

2.2姜黄素对CNE-2细胞凋亡的影响 流式细胞检测结果显示，0、10、20、40及60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，CNE-2细胞凋亡率随着姜黄素浓度增加而上升，其中40 μmol/L和60 μmol/L姜黄素作用条件下细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3姜黄素对CNE-2细胞凋亡形态学的影响 荧光染色结果可见，未经姜黄素(0 μmol/L)处理CNE-2细胞培养24 h后，细胞呈圆形或者椭圆形，细胞核大小均匀一致，染色质分布均匀的淡蓝色荧光；10 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞胞体缩小，细胞核染色质凝聚，呈颗粒状亮蓝色荧光；20 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞出现胞体缩小，细胞核浓缩、染色质不均匀，出现凋亡小体，甚至出现核碎裂；40、60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞凋亡小体数量增多，出现大量核碎裂，见图3。

A：姜黄素处理CNE-2细胞的生长抑制曲线；B：姜黄素处理CNE-2细胞不同时间IC50；*：P<0.05；**：P<0.01

图1 姜黄素对CNE-2细胞增殖的影响表1 不同浓度姜黄素处理CNE-2细胞的抑制率

*：P<0.05，与0 μmol/L比较；#：P<0.05，与10 μmol/L比较；△：P<0.05，与20 μmol/L比较

*：P<0.05；**：P<0.01

图2姜黄素对CNE-2细胞凋亡的影响

→:指向凋亡小体

图3不同浓度姜黄素对CNE-2细胞凋亡形态学的影响

3 讨 论

NPC是指发生于鼻咽腔顶部及侧壁的头颈部恶性肿瘤[6]，是我国高发性恶性肿瘤之一，其发病率位居耳鼻咽喉恶性肿瘤首位。NPC临床上以鼻塞、涕中带血、听力下降、耳闷堵感、头痛、复视等为主要症状，由于其解剖结构较为特殊，手术治疗难度较大，临床上常采用放射治疗为其首选治疗方法[7]。放射治疗在取得一定疗效的同时，给患者带来了极大的痛苦及不良反应，且存在一定的局部病灶残留，20%～30%患者经放射治疗后存在局部或者颈部复发及远处转移，可见放射治疗对于NPC仍存在较高的失败率。因此，寻找高效、低毒、特异的治疗性药物是目前NPC治疗亟待解决的主要问题之一。

中药以其安全性高、治疗多靶点、毒性小等特点在临床抗肿瘤治疗中得到了广泛应用，发掘新的有效中药活性成分是目前肿瘤治疗的潜在策略。姜黄素是姜科姜黄属植物根茎中所提取的多酚化合物，因具有抗炎、抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，成为了近年来国内外研究的热点[8-10]。1985年有学者提出姜黄素具有抗肿瘤作用，此后多项研究证实，姜黄素可通过调控肿瘤细胞生长信号传导通路、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成及增加肿瘤细胞对放射治疗敏感性等发挥抗肿瘤作用[11]。抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥抗肿瘤作用的共同途径。刘斌等[12]研究表明，姜黄素可诱导人黑色素瘤细胞发生凋亡从而发挥抗肿瘤作用；郭立达等[13]研究提出，姜黄素可明显抑制人结肠癌LoVo细胞增殖并诱导其凋亡；李会宣等[14]提出姜黄素可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。有关姜黄素对人NPC细胞增殖及凋亡影响的研究较少，本研究选用国内临床最为常见的NPC低分化鳞癌细胞株CNE-2为研究对象，探究姜黄素对其增殖及凋亡的影响。

本研究结果表明，姜黄素可显著抑制CNE-2细胞增殖作用，且随姜黄素浓度增加，CNE-2细胞抑制率呈上升趋势，姜黄素作用CNE-2细胞24、48、72 h的IC50分别为(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L，提示姜黄素可显著抑制CNE-2细胞增殖，且呈现明显的浓度、时间依赖性；流式细胞检测结果显示，姜黄素处理CNE-2细胞后细胞凋亡率增加，提示一定浓度姜黄素可明显诱导CNE-2细胞凋亡，且随着姜黄素浓度增加，CNE-2细胞凋亡率呈现明显升高趋势；荧光染色结果可见，未经姜黄素处理CNE-2细胞培养24 h后，细胞呈圆形或者椭圆形，细胞核大小均匀一致，染色质分布均匀的淡蓝色荧光；10 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞胞体缩小，细胞核染色质凝聚，呈颗粒状亮蓝色荧光；20 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞出现细胞胞体缩小，细胞核浓缩、染色质不均匀，出现凋亡小体，甚至出现核碎裂；40、60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后，细胞凋亡小体数量增多，出现大量核碎裂，细胞形态学改变是细胞凋亡的典型特征，证实姜黄素可诱导CNE-2细胞凋亡，且一定浓度范围内，随姜黄素浓度的增加，CNE-2细胞凋亡逐渐增强。

综上所述，姜黄素对NPC细胞株CNE-2细胞增殖具有明显的抑制作用，且诱导CNE-2细胞凋亡，为姜黄素应用于NPC治疗提供了一定的理论依据。细胞凋亡是一个复杂的生物学过程，姜黄素诱导CNE-2细胞凋亡的作用机制，仍有待进一步深入研究。

[1]马骏．鼻咽癌治疗的研究进展[J]．中山大学学报(医学科学版)，2010，31(2)：179-185．

[2]魏矿荣，余元龙，杨有业，等．中国鼻咽癌流行概况[J]．实用预防医学，2010，17(4)：828-830．

[3]尤茜，杨玉成．放化疗联合治疗局部晚期鼻咽癌的临床研究[J]．临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2014，28(6)：376-380．

[4]毕文杰，穆小静，祖丽皮艳·阿布力米特，等．姜黄素新型靶向制剂研究进展[J]．中国药学杂志，2015，50(4)：323-329．[5]范昊宁，佟丽，范钦．姜黄素对肿瘤的抑制和放射增敏作用研究进展[J]．中国实验方剂学杂志，2013，19(3)：333-335．

[6]Zada G，Lopes MBS，Mukundan S，et al．Nasopharyngeal carcinoma and squamous cell carcinoma of the paranasal sinuses[M]//Zada G，Lopes M，Mukundan Jr S，et al．Atlas of Sellar and Parasellar Lesions．Springer International Publishing，2016：359-365．

[7]Blanchard P，Lee A，Marguet S，et al．Chemotherapy and radiotherapy in nasopharyngeal carcinoma:an update of the MAC-NPC meta-analysis[J]．Lancet Oncol，2015，16(6)：645-655．

[8]向鑫，袁继超，陈飞，等．姜黄素诱导内源性神经干细胞促进大鼠脊髓损伤后功能修复[J]．第三军医大学学报，2014，36(9)：883-887．

[9]汪丛丛，庄静，冯福彬，等．姜黄素抑制肺癌细胞血管拟态形成机制探讨[J]．中华肿瘤防治杂志，2015，22(4)：243-246．

[10]Yadav VR，Prasad S，Kannappan R，et al．Cyclodextrin-complexed curcumin exhibits anti-inflammatory and antiproliferative activities superior to those of curcumin through higher cellular uptake[J]．Biochem Pharmacol，2010，80(7)：1021-1032．

[11]姚庆华，林妙，汪玉琪，等．氧化应激在姜黄素诱导肺癌细胞凋亡中的作用及机制研究[J]．中华中医药杂志，2016，31(2)：614-618．

[12]刘斌，邓辰亮，杨松林，等．姜黄素对人黑色素瘤细胞凋亡机制探讨[J]．中华肿瘤防治杂志，2014，21(14)：1059-1062．

[13]郭立达，焦振霞，宋瑛，等．姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡的作用及机制研究[J]．中国中药杂志，2013，38(13)：2191-2196．

[14]李会宣，杨虹，张红兵，等．姜黄素通过MAPK信号通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡[J]．天然产物研究与开发，2014，26(3)：329-334．

EffectsofcurcuminonproliferationandapoptosisofhumannasopharyngealcarcinomacelllineCNE-2*

LiWenquan1,CaoZhongsheng1△,QianWei2

(1.DepartmentofENT,theSecondAffiliatedHospital,SuzhouUniversity,Suzhou,Jiangsu215000,China;2.DepartmentofENT,ZhenjiangMunicipalFirstPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE-2.MethodsThe CNE-2 cells were treated by by different concentrations (0,10,20,40,60 μmol/L) of curcumin.The proliferation activity of CNE-2 cells was detected by MTT assay,the cell cycle and apoptosis rate of CNE-2 were detected by using the flow cytometry (FCM),and the apoptosis was observed by Hoechest33258 fluorescence staining.ResultsCurcumin could significantly inhibit the proliferation of CNE-2 cells,moreover which was increased with curcumin concentration increase,the inhibitory rate of CNE-2 cells showed an increasing trend (P<0.05),the half inhibitory concentrations (IC50) of curcumin acting on CNE-2 cells at 24,48,72 h were (23.54±0.36),(18.31±0.42) and (8.56±0.37)μmol/L respectively.Curcumin could significantly inhibit the proliferation effect of CNE-2 cells,showing the apparent concentration and time dependence.The FCM detection results showed that in treating CNE-2 cells by 0,10,20,40,60 μmol/L of curcumin,the apoptosis rate was increased with the curcumin concentration increase;the fluorescence staining results showed that CNE-2 cells without curcumin treatment were round or oval,the cell nucleis were uniform in size,chromatin distribution showed the homogeneous light blue fluorescence;after 24 h of 10 μmol/L curcumin treatment,the CNE-2 cell body was shrunk and cell nuclear chromatin was condensed,showing granular bright blue fluorescence;after 24 h of 20 μmol/L curcumin treatment,the cell body was shrunk,nuclear was condensed,chromatin was uneven,apoptotic bodies appeared,and even the nuclear fragmentation appeared;after 24 h of 40 μmol/L and 60 μmol/L curcumin treatment,the number of apoptotic cells was increased,a large number of nuclear fragmentation appeared.ConclusionCurcumin has a significant inhibitory effect on the proliferation of NPC cell line CNE-2,moreover promotes the apoptosis of CNE-2 cells.

curcumin；nasopharyngeal neoplasms；CNE-2 cells；cell proliferation；apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.006

2011年江苏省六大人才高峰项目(2011-021)；江苏省苏州市科技局资助项目(SYS201233)。

李文全(1980-)，主治医师，硕士，主要从事耳鼻喉喉头颈外科疾病治疗研究。△

，E-mail：cao40181@163.com。

R739.63

A

1671-8348(2017)35-4917-03

2017-07-21

2017-10-02)