生物炭不同施用量对烟草内生细菌多样性的影响

夏体渊，陈泽斌，靳 松，赵 凤，王定康，郭丽红，徐胜光

(1.昆明学院 农学院，云南 昆明 650214；2.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；3.云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214)

生物炭不同施用量对烟草内生细菌多样性的影响

夏体渊1,2，陈泽斌1，靳 松1，赵 凤1，王定康1，郭丽红3，徐胜光2*

(1.昆明学院 农学院，云南 昆明 650214；2.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；3.云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214)

【目的】为了对施用生物炭后的烟叶细菌的种类变化进行全面而准确的调查。【方法】以烟叶为研究对象，设置4个处理：处1理为施用生物炭50 g/株(Y4.1)；处理2为施用生物炭100 g/株(Y5.1)；处理3为施生物炭150 g/株(Y6.1)和处理4不施用生物炭作为对照(Y1.1)。应用Illumina测序平台的MiSeq高通量测序仪对施用生物炭后烟叶内生细菌的16S rDNA-V4区扩增子进行测序。并应用Qiime和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量，分析物种的丰度和Alpha多样性。【结果】在97 %的序列相似性水平上把所测得的序列划分为1177、1429、1228、1182操作分类单元(OTUs)。通过OTU丰度聚类分析表明：施用生物炭处理后样品的OTUs数低于不施用生物炭处理，说明施用生物炭能提高烟叶细菌群落丰度；施用生物炭50 g/株处理后样品的OTUs数高于施用生物炭100 g/株处理，施用生物炭100 g/株处理后样品的OTUs数高于施用生物炭150 g/株处理，说明随着施炭量增加到100、150 g/株细菌群落丰度又开始减少。【结论】通过属的水平分析表明：鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在施用生物炭处理的样品中丰度比不施用生物炭处理的高，说明施用生物炭有利于增加该菌属的丰度。芽球菌属(Blastococcus)、Solirubrobacter属、Gaiella属、节细菌属(Arthrobacter)这4个属在施用生物炭50 g/株处理的样品中丰度大于不施用生物炭处理，在不施用生物炭处理的样品中丰度大于施用生物炭100、150 g/株处理，说明施用生物炭超过50 g会降低这4个菌属的丰度。

烟草；内生细菌；生物炭；测序；多样性

【研究意义】生物炭是生物有机材料(生物)在缺氧或厌氧环境下高温裂解产生的一种固体[1]。在以往的研究中，生物炭作为一种新型的碳材料，引起了广泛的关注，主要是因为其在土壤改良、减少温室气体排放和环境修复中的应用潜力，它可以为解决诸如农田肥力下降等环境问题提供新的思路[2]。使用生物炭肥对根结线虫有很好的抑制作用[3]。生物炭基质有助于烟苗地上、地下部干重的积累，证明可以使用生物炭基质替代常规基质[4]。施用生物炭和石灰均能促进红壤中烟草的生长，并有效改善红壤的理化性状[5]。生物炭与常规肥料配施能显著提高烟草各部位生物量及烟叶抗氧化酶活性，促进烟株的生长[6]。施用生物炭能促进烤烟生长，烟叶产量呈增加趋势，然而，当生物炭用量达到2 025 kg/hm2时，烟叶质量开始下降[7]。【前人研究进展】植物内生菌是指整个生命周期都在宿主植物体内生存的细菌、放线菌和真菌，其存在于所有植物中。内生菌的次生代谢产物丰富多样，在农业和医药工业中具有重要的应用价值[8]，是生物活性物质筛选的重要来源[9-13]。韩玮等人以南方水稻土为研究对象，施用不同温度处理后的生物炭后，结果表明施加生物炭后土壤微生物量相比对照有所提高[14]。廖娜通过田间实验对滴灌棉田土壤施用不同类型的生物炭，结果表明施用生物炭提高土壤碳氮转化相关的酶活性和微生物群落对碳源底物的利用能力，改变土壤微生物群落结构组成[15]。尚杰等人通过大田实验对耧土施用生物炭，结果表明施用生物炭对耧土土壤中微生物量有所增加，土壤中酶的活性得到提高[16]。胡锋等人通过室内培育实验对江西红壤水稻土施用生物质炭，结果表明加入生物质炭后土壤中有机碳和微生物生物量碳氮的含量显著增加[17]。【本研究切入点】在前人的研究进展中所采用的都是一代测序技术，然而早期第一代测序技术仍然存在诸如文库构建过程复杂、测序成本依然较高、通量低、难以做大量的平行测序等缺点。为了克服上述缺点，近年来发展的新二代测序技术，不仅在文库构建等方面取得了重要突破，更进一步简化了测序操作、降低了测序成本、缩短了测序时间。【拟解决的关键问题】在本研究中，将Illumina MiSeq二代测序技术应用于生物炭施用后的烟草内生细菌种类组成研究，与传统的纯培养方法和基于16S rDNA的非培养方法相比，可以产生覆盖深度较大的数据，能准确调查生物炭对烟草内生细菌物种的影响，为丰富植物微生态学理论奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2016年3月20日到宣威市洛水镇，在农民连作3年的烟地设计田间试验，选择一块烤烟连作地进行整地栽种烤烟。设置4个处理：处理1为不施用生物炭，处理2为每株施用生物炭50 g，处理3为每株施用生物炭100 g，处理4为每株施用生物炭150 g。种植烟苗时就施用生物炭，与底肥混匀施入。于2016年7月18日采集成熟期无明显病虫害的烤烟叶片，放入样品袋中，并表标写样品名，不施用生物炭样品编号为Y1.1，施用生物炭50 g样品编号为Y4.1，施用生物炭100 g样品编号为Y5.1，施用生物炭150 g样品编号为Y6.1。

1.2 表面消毒和总DNA提取

方法参照文献[18-19]。

1.3 16S rDNA-V4区的PCR扩增

以稀释后的基因组DNA为模板，使用特异引物515F(5’-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-AGTTCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)进行PCR扩增。扩增产物的测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成[20-22]。

1.4 生物信息学分析

用Flash软件对原始数据进行拼接，Qiime软件过滤，Uchime Algorithm软件去除嵌合体，得到有效数据(Effective tags)[23]，然后用Uparse软件在97 %水平上对有效数据进行操作分类单元(Operational taxonomic unit, OTU)划分，利用Greengene数据库进行物种注释[24]，利用Mothur软件做稀释曲线分析，通过对OTUs进行丰度和α-多样性分析，得到微生物群落结构组成[25-26]。

2 结果与分析

2.1 测序结果及序列深度验证

4个样品测得原始序列条数为60 312、50 468、34 884、57 896条，总计203 560条，过滤掉低质量的序列后，得到的序列数为58 938、49 319、34 022、56 555条，总计198 834条。在上述序列进行去冗余处理后，有效序列数为58 659、48 851、33 896、56 342条，总计197 748条，一共被划分为5 016个OTUs(表1)。施用50 g生物炭处理后，叶片中细菌香农指数最高，施用生物炭150 g处理后叶片中细菌香农指数仅次于样品Y4.1，与对照样品Y1.1不施用生物炭处理的叶片比较，样品Y5.1施用生物炭100 g处理后的叶片中细菌香农指数还是高于样品Y1.1中细菌的香农指数。说明施用生物炭处理后的烟叶内细菌的香农指数高于不施用生物炭处理。4个样品中细菌香农指数高低为：Y4.1 > Y6.1 > Y5.1 > Y1.1，结果表明烤烟在施用生物炭的条件下细菌群落种群多样性比不施用生物炭高，施用生物炭50 g时达到最大，施用100 g时降低，当施用量增加到150 g时又开始增高。整体从覆盖率上看，4个样品的覆盖率均达到了98 %以上，说明大部分的细菌序列都已经被测出，结果有很好的可信度。

表1 细菌OTU丰度和α多样性指数

2.2 样品复杂度分析

从OTU的稀释曲线可以看出4个样品稀释曲线均基本趋于平缓(图1)，随着测序数量的增加，细菌稀释曲线斜率逐渐趋于平坦，即使增加测序数量也只会产生少量的新操作分类单元；说明测序数据足够多，可以反映样品中的细菌种类。

图1 细菌OTU稀释曲线 Fig.1 Bacteria OTU dilution curve

2.3 各样品中细菌群落相关性分析

从图2数据分析，得到4个样品细菌文库共有5016个OTUs ，从特有的OTUs个来看，样品Y1.1有57个OTUs、样品Y5.1有54个OTUs、样品Y6.1有55个OTUs、样品4.1有147个OTUs。施用生物炭50 g比不施用生物炭多90个OTUs，施用生物炭100 g比不施用生物炭少3个OTUs，施用生物炭150 g比不施用生物炭少2个OTUs，说明施用生物炭50 g有利于提高烟叶内生细菌种类的数量，但施用生物炭增加到100、150 g时，会减少烟叶内生细菌的种类。还发现有705个OTUs在4个样品中均有分布，只占文库OTUs总数的14.1 %，说明施用生物炭和不施用生物炭烟叶内生细菌的种类组成差异大；通过比较发现，施用生物炭50 g处理、施用生物炭100 g处理和施用生物炭150 g处理，细菌文库共有OTUs数量为3839个，其中有825个OTUs在4个样品中均有分布，只占相应文库OTUs总数的21.5 %，说明生物炭不同施用量对烟叶内生细菌的种类分布有很大影响。

2.4 各样品中细菌群落分布特征分析

如图3～5所示，利用RDP classifier 对各样品中OTU 依次进行门(Phylum)、纲(Class)、科(Family)、属(Genus)分类信息分析。本研究采用的是CTAB法提取烤烟叶基因组DNA，因为植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA与细菌16S rDNA序列具有高度同源性，所以出现了蓝藻细菌门(Cyanobacteria，83.90 %)中叶绿体(unidentified chloroplast，83.90 %)和变形菌门(Proteobacteria，12.78 %)中(Unidentified Mitochondria，12.78 %)线粒体污染宿主的现象。通过图表分析，把4个样本中所有的细菌按门、纲、目、科、属依次划分，共有4个门。其中优势群落为变形菌门(Proteobacteria)，占总菌落的12.78 %，分为2个纲为α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)，占12.37 %，又分两目为立克次氏体目(Rickettsiales)，占10.36 %；另一个目为鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)，占2.01 %，由鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae，2.01 %)，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，2.01 %)；δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)，占0.41 %，黏球目(Myxococcales，0.41 %)，Haliangiaceae科(0.41 %)，Haliangium属(0.41 %)；第2个门是放线菌门(Actinobacteria)，占2.84 %；分为2个纲，Thermoleophilia 纲(1.17 %)，unidentified Actinobactria纲(1.67 %)，分别有5个目：Gaiellales目(0.55 %)，Gaiellaceae 科(0.55 %)，Gaiella属(0.55 %)；Solirubrobacterales目(0.62 %), Solirubrobacteraceae科(0.62 %)，Solirubrobacter属(0.62 %)；Frankiales目(0.72 %)，地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae，0.62 %)，芽球菌属(Blastococcus，0.72 %)；微球菌目(Micrococcales，0.46 %)，微球菌科(Micrococcaceae，0.46 %)，节细菌属(Arthrobacter，0.46 %)；链霉菌目(Streptomycetales，0.49 %)，链霉菌科(Streptomycetaceae，0.49 %)，链霉菌属(Streptomyces，0.49 %)。第3个门是芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，占0.48 %，有一个纲为不明芽单胞菌纲(unidentified Gemmatimonadetes，0.48 %)，芽单胞菌目(Gemmatimonadales，0.48 %)，芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae，0.48 %)，芽单胞菌属(Gemmatimonas0.48 %)。从属的水平上来看，可发现鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在每个样品中都是优势菌属，但在样品Y4.1中占的比例最大，占3.45 %，比样品Y1.1(占1.17 %)不施用生物炭处理多出2.28 %，在样品Y5.1中占2.01 %，在样品Y6.1中占了1.77 %，分别比样品Y1.1多出0.84 %、0.60 %，表明施用生物炭提高了这个菌属的分布，但施用量超过50 g后又开始减少。芽球菌属(Blastococcus)在样品Y1.1和样品Y4.1中为第2优势菌属，各占0.62 %、1.62 %，在样品Y4.1中明显比样品Y1.1高出1 %，在样品Y5.1和Y6.1中各占了0.46 %、0.38 %，明显比样品Y1.1少0.16 %、0.24 %。Solirubrobacter属在4个样品Y1.1、Y4.1、Y5.1、Y6.1中各占0.61 %、1.31 %、0.47 %、0.24 %，只有Y4.1中占的比例大于样品Y1.1，大出0.70 %，在样品Y5.1和样品Y6.1中都比样品Y1.1小。Gaiella属在样品Y4.1中占的比例最大，占1.14 %，在Y1.1中次之，占0.5 %，第3是样品Y5.1中，占0.44 %，在样品Y6.1中最小，占0.27 %，相比之下，施用生物炭50 g提高了这3个菌属的分布，当施用生物炭为100 g、150 g时，这3个菌属的分布随施用量的增加而减低，并且比对照样品Y1.1中的分布还少。节细菌属(Arthrobacter)在样品Y4.1中占的比例最高，占0.88 %，比样品Y1.1(占0.27 %)高出0.61 %，在样品Y5.1中占了0.47 %，比样品Y1.1高出0.20 %，在样品Y6.1中占了0.33 %，只比样品Y1.1高出0.06 %；链霉菌属(Streptomyces)在样品Y4.1中占1.11 %，比样品Y1.1(占0.35 %)高出0.76 %，在样品Y5.1中占0.24 %，比样品Y1.1少0.11 %，在样品Y6.1中占0.41 %，只比样品Y1.1高出0.06 %；芽单胞菌属细菌(Gemmatimonas)在样品Y4.1中占1.12 %，比样品Y1.1(占0.40 %)高出0.72 %，在样品Y5.1中占了0.24 %，比样品Y1.1少0.16 %，在样品Y6.1中占0.29 %，比样品Y1.1少0.11 %；Haliangium属在样品Y4.1中占0.82 %，比样品Y1.1(占0.28 %)高出0.54 %，在样品Y5.1中占0.40 %，比样品Y1.1高出0.12 %，在样品Y6.1中占0.26 %，只比样品Y1.1少0.02 %

图2 烟叶内生细菌OTU韦恩图Fig.2 OTU Venn diagram of tobacco endophytic bacteria

图3 纲水平上的细菌类群丰度Fig.3 Abundance of bacteria groups on class level

图4 科水平上的细菌类群丰度Fig.4 Abundance figure of bacteria groups on family level

图5 属水平上的细菌类群丰度Fig.5 Abundance of bacteria groups on genus level

图6 PCA分析结果Fig.6 PCA analysis results

2.5 样品间Beta多样性分析

基于OTU水平的PCA分析结果展示如图6所示。从图6可以看出，PCA主成分分析表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的差异贡献率分别为49.27 %和25.92 %，合计达到75.19 %，表明除了主成分1和主成分2对样品差异有影响外还有其他成分对其差异也有影响。对样品在各主成分的影响进行绘图可以看出，样品Y5.1施用生物炭100 g和样品Y6.1施用生物炭150 g均位于PC1和PC2的负轴区，说明2个样品间的差异最小。样品Y1.1不施用生物炭和样品Y4.1施用生物炭50 g间的距离最远，所以这2个样品间的差异最大，其次是样品Y6.1施用生物炭150 g和Y1.1不施用生物炭均在PC2的负轴区，但从PC1来看，一个在负轴区一个在正轴区，说明2个样品的差异来自于主成分1。样品Y5.1施用生物炭100 g和样品Y1.1不施用生物炭也有较大的差异，差异来自于主成分2。相比之下样品Y4.1、样品Y5.1、样品Y6.1间的差异要小于与样品1.1的差异，说明施用过生物炭后的烟叶内和不施用生物炭的烟叶内细菌群落差异是比较大的。从施用过生物炭的样品中来看，样品Y4.1施用50 g和样品Y5.1施用生物炭100 g、样品Y6.1施用生物炭150 g间的差异都比较大，说明施用生物炭50 g对烟草叶片内细菌群落结构有很大的影响。

3 讨 论

本研究将Illumina MiSeq第二代测序技术应用于植物内生细菌研究，不但把解析微生物群落结构从传统分子生物学方法提升到基因组的水平上，还克服了以往在传统分子生物学方法存在着通量低的缺陷，与传统的纯培养方法及16S rDNA非培养方法相比较，高通量测序技术涵盖了整个微生物群落的信息，可以检测到一代测序技术不能发现的低丰度内生细菌种类，丰富植物内生菌资源。通过利用高通量测序对烟叶内生细菌16S rDNA-V4区进行测序，经过对比分析4个样品中优势群落为变形菌门(Proteobacteria，12.78 %)，此外还检测到一些几乎没有报道过的低丰度细菌类群，例如：Solirubrobacter属(0.61 %)、Gaiella属(0.55 %)、Haliangium属(0.41 %)，显示出了新一代测序技术的优势。在以往通过传统组织分离方法对烤烟内生细菌进行分离鉴定的报道中，均发现优势菌变形菌门Proteobacteria的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌[20]，这与本研究的结果不一致，这可能与烟草品种及生长环境有关，研究表明，同一种植物栽培在不同的地方可能有着不同的内生菌组成特征[10]。也可能与芽孢杆菌属(Bacillus)细菌在植物体内多是以孢子形式存在有关，而提取植物组织DNA目前多采用CTAB、SDS法，无法使其裂解，导致未能获取到该类群细菌的基因组DNA。

本研究全面而准确地分析了4个烟草样品Y1.1不施用生物炭、Y4.1施用生物炭50 g/株、Y5.1施用生物炭100 g/株、Y6.1施用生物炭150 g/株的内生细菌的种类分布，发现鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在每个样品中都是优势菌属，但在施用生物炭处理后的样品中的丰度比不施用生物炭处理的高，表明施用生物炭提高了这个菌属在烟叶内的分布，但施用量增加到100、150 g/株后在烟叶内的分布又开始降低。芽球菌属(Blastococcus)、Solirubrobacter属、Gaiella属这3个菌属在样品Y4.1中的丰度最大，在样品Y1.1中次之，说明施用生物炭50 g/株提高了这3个菌属在烟叶内的分布，当施用生物炭为100、150 g/株时，这3个菌属的分布随施用量的增加而降低，并且比在对照样品Y1.1中的分布还少。

4 结 论

施用生物炭对烟叶中细菌群落分布多样性确实有很大的影响，研究表明施用生物炭50 g/株后烟叶中细菌群落丰度大于不施用生物炭烟叶中细菌群落丰度。说明施用生物炭50 g/株对烟叶中细菌群落丰度影响最大，施用生物炭100 g/株后烟叶中细菌群落丰度有所减少，施用生物炭150 g/株后烟叶中细菌群落丰度最小。施用生物炭量为100、150 g/株时会使烟叶中的个别菌属的丰度有所减少，例如：芽球菌属(Blastococcus)、Solirubrobacter属、Gaiella属、节细菌属(Arthrobacter)这几个属，说明生物炭施用量超过50 g/株会抑制这几个菌属的生长。

[1]陈温福, 张伟明, 孟 军. 农用生物炭研究进展与前景[J]. 中国农业科学, 2013, 46(16): 3324-3333.

[2]徐楠楠, 彭强辉, 郭文娟, 等. 生物炭在土壤改良和重金属污染治理中的应用[J]. 农业环境与发展, 2013, 7(4): 29-34.

[3]杨惟薇, 张超兰, 潘丽萍, 等. 水稻秸秆和蚕沙生物炭对玉米植株镉累积的影响[J]. 西南农业学报, 2017, 30(5): 1115-1120.

[4]张 春, 赵浩淳, 郭 涛, 等. 生物炭用量对烟苗生长的影响[J]. 烟草科技, 2015, 48(6): 9-12, 26.

[5]陈 敏, 杜相革. 生物炭对土壤特性及烟草产量和品质的影响[J]. 中国土壤与肥料, 2015, 35(1): 80-83.

[6]许跃奇, 赵铭钦, 尤方芳, 等. 生物炭与常规施肥对烟草生长及镉污染吸收的影响[J]. 土壤, 2016, 48(3): 510-515.

[7]刘新源, 刘国顺, 刘宏恩, 等. 生物炭施用量对烟叶生长、产量和品质的影响[J]. 河南农业科学, 2014, 43(2): 58-62.

[8]杨绍周, 吴毅歆, 邵德林, 等. 鼓槌石斛内生细菌分离、鉴定及功能分析[J]. 中国农学通报, 2014, 30(25): 171-176.

[9]徐文婷, 张雅琼, 董文汉, 等. 石斛内生真菌固体菌剂对铁皮石斛组培苗促生作用研究[J]. 西南农业学报, 2014, 27(1): 317-324.

[10]童文君, 张 礼, 薛庆云, 等. 不同产地美花石斛内生细菌分离及促生潜力比较[J]. 植物资源与环境学报, 2014, 23(1): 16-23.

[11]冯永君, 宋 未. 植物内生细菌[J]. 自然杂志, 2001, 23(5): 249-252.

[12]侯晓强, 郭顺星. 铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(17): 3232-3237.

[13]阮丽军. 植物内生菌生物活性物质的研究[D]. 上海医药工业研究院, 2006.

[14]韩 玮, 申双和, 谢祖彬, 等. 生物炭及秸秆对水稻土各密度组分有机碳及微生物的影响[J]. 生态学报, 2016, 36(18): 5838-5846.

[15]廖 娜. 生物碳对滴灌棉田土壤微生物的影响[D]. 石河子大学, 2016.

[16]尚 杰, 耿增超, 王月玲, 等. 施用生物炭对(土娄)土微生物量碳、氮及酶活性的影响[J]. 中国农业科学, 2016, 49(6): 1142-1151.

[17]匡崇婷, 江春玉, 胡 锋, 等. 添加生物质炭对红壤水稻土有机碳矿化和微生物生物量的影响[J]. 土壤, 2012, 44(4): 570-575.

[18]陈泽斌, 代方平, 寸林江, 等. 烟草内生细菌分离方法的优化研究[J]. 中国烟草学报, 2014, 20(1): 90-95.

[19]邱服斌. 培养方法与非培养方法对人参根内生细菌的研究[D]. 北京: 首都师范大学, 2007.

[20]Caporaso J G, Lauber C L, Walters W A, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millionsof sequences per sample[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108 (Suppl 1): 4516-4522.

[21]Youssef N, Sheik C S, Krumholz L R, et al. Comparison of species richness estimates obtained using nearlycomplete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(16): 5227-5236.

[22]Hess M, Sczyrba A, Egan R, et al. Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes fromcow rumen[J]. Science, 2011, 331(6016): 463-467.

[23]Edgar R C, Haas B J, Clemente J C, et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics, 2011, 27(16): 2194-2200.

[24]Edgar R C. UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996-998.

[25]Wang Q, Garrity G M, Tiedje J M, et al. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267.

[26]DeSantis T Z, Hugenholtz P, Larsen N, et al. Greengenes,a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(7): 5069-5072.

EffectofDifferentBiocharApplicationRatesonDiversityofTobaccoEndophyticBacteria

XIA Ti-yuan1,2, CHEN Ze-bin1, JIN Song1, ZHAO Feng1, WANG Ding-kang1, GUO Li-hong3, XU Sheng-guang2*

(1.College of Agriculture,Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Engineering Research Center for Biochar of High Education in Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 3. Key Laboratory of Development and Utilization of Characteristic Biological Resources in Universities of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China)

【Objective】The study aims to conduct a comprehensive and accurate investigation on the species change of bacteria in tobacco leaves after the application of biochar. 【Method】Tobacco was chosen as the object of this study, and 4 treatments were set including treatment 1, the application of biochar 50 g each plant (Y4.1); Treatment 2, the application of biochar 100 g each plant (Y5.1); Treatment 3, the application of biochar 150 g each plant (Y6.1); And treatment 4, as control group without biochar (Y1.1). Amplicons in 16S rDNA-V4 region of endophytic bacteria from biochar-applied tobacco were sequenced by the use of MiSeq high-throughput sequencer from Illumina sequencing platform. And Qiime and Mothur were adopted to sort out and calculate the number of sample sequences and operational taxonomic units (OTUs) and analyze abundance and Alpha diversity of species. 【Result】The measured sequences were divided into 1177, 1429, 1228 and 1182 OTUs at 97 % of sequence similarity level. OTU abundance clustering analysis showed that the number of OTUs with the application of biochar was higher than that of non-biochar treatment, which indicated that the application of biochar could increase the abundance of tobacco bacteria groups; The number of OTUs with the treatment of 50 g each plant biochar was higher than that of 100 g each plant biochar and the later was higher than that of 150 g each plant, which indicated that as the weight of biochar increased to 100 g each plant and 150 g each plant, the abundance of tobacco bacteria groups began to decrease. 【Conclusion】The analysis on genus level showed that the abundance ofSphingomonasin the samples treated with biochar was higher than that without biochar treatment, which demonstrated that the application of biochar was beneficial to the abundance of this genus. The abundances ofBlastococcus,Solirubrobacter,GaiellaandArthrobacterin samples treated with 50 g each plant biochar were higher than those without biochar treatment, and the later were greater than those with 100 g each plant and 150 g each plant treatments, indicating that the application of biochar over 50 g each plant would inhibit the growth of these 4 genera.

Tobacco; Endophytic bacteria; Biochar; Sequencing; Diversity

1001-4829(2017)12-2711-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.016

2016-12-26

国家自然科学基金项目(41361056)；昆明学院“人才引进项目”(YJL14005)；云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目(05000511311)；云南省特色生物资源开发与利用重点实验室开放基金项目(GXKJ201631)

夏体渊(1978-)，男，云南宣威人，博士，副研究员，主要从事山区农业可持续发展研究，E-mail: xiatiyuan@sohu.com；*为通讯作者：徐胜光，E-mail: sgxu2011@126.com。

S572.06

A

(责任编辑王家银)